酸性磷酸酶检测试剂盒(PNP比色法).doc

酸性磷酸酶(ACP)检测试剂盒(PNP比色法) 简介： 酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)分布极广泛，遍布各种组织，主要存在于细胞的溶酶体内，所以常作为溶酶体标志酶。溶酶体外的酸性磷酸酶存在于内质网和胞质内，各种动物中的酸性磷酸酶各有不同，酸性磷酸酶的适宜pH为4.5～5.5。酸性磷酸酶是一个蛋白家族，哺乳动物中其分子量从18kD到100kD不等，该酶分为两类，一类为酒石酸盐敏感型，一类为氟离子敏感型。溶酶体中的酸性磷酸酶为酒石酸盐敏感型，而红细胞和巨噬细胞中的酸性磷酸酶为氟离子敏感型。 Leagene酸性磷酸酶(ACP)检测试剂盒(PNP比色法)(Acid Phosphatase Colorimetric Assay Kit)检测原理是利用Para-nitrophenyl phosphate (pNPP)为一种常用的磷酸酶显色底物，在酸性条件下，可在酸性磷酸酶的作用下生成p-nitrophenol。在碱性条件下p-nitrophenol呈黄色，产物黄色越深，说明酸性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过分光光度比色法(分光光度计)测定处吸光度，据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的酸性磷酸酯酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 编号 名称 TE0034 60T Storage 试剂(A): ACP Assay buffer 50ml 4℃ 试剂(B): pNPP 2支 -20℃ 避光 试剂(C): p-nitrophenol(10mM) 0.2ml -20℃ 避光 使用说明书 1份 ? ? ? 自备材料： 1、 比色杯 2、 水浴锅或恒温箱 3、 分光光度计 操作步骤(仅供参考)： 1、 准备样品： 血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，冻存，用于酸性磷酸酶的检测。 细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要可用PBS或生理盐水进行适当匀浆，一般细胞数量在106以上，组织应在100mg以上，离心取上清，冻存，用于酸性磷酸酶的检测。 植物样品：取适量的植物组织加入少量生理盐水或PBS，充分捣碎或研磨，静置，用纱布或滤纸过滤，离心，留取上清液并测量体积，冻存，用于酸性磷酸酶的检测。 高活性样品：如果样品中含有较高活性的酸性磷酸酶，可以使用原有的裂解液或PBS等进行稀释，也可以采用ACP Assay buffer稀释。 2、 配制检测工作液： 配制显色工作液： 取出1支pNPP，恢复至室温后溶解于ACP Assay buffer，混匀，冰上预冷备用。新配制的显色工作液应及时用完。 配制标准品工作液：取出p-nitrophenol 恢复至室温后，取溶解于 ACP Assay buffer，使浓度达到一定程度。 3、 加样：按照下表设置空白对照、标准品、待测样品，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。标准品的用量分别为0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.3ml，待测样品直接加0.3ml。如果样品中的酸性磷酸酯酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。样品的检测最好能设置平行管。 ? 空白对照管 标准品管 待测样品管 ACP Assay buffer 0.3ml (0.3-x)ml (0.3-y)ml 显色工作液 0.3ml 0.3ml 0.3ml 待测样品 — — yml 标准品工作液 — xml — ? ? ? ? 4、 轻轻混匀，孵育。 5、 每孔加入Stopping Solution终止反应。 6、 比色杯光径，分光光度计检测处吸光值，如果无法检测，亦可检测范围内吸光值，一般应数小时内检测完毕。 计算： 酸性磷酸酶活性单位的定义：pH4.8 37℃条件下，每分钟水解para-nitrophenyl phosphate显色底物产生1微摩尔p-nitrophenol所需的酸性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位。根据酶活性定义，计算出样品中的酸性磷酸酯酶活性。血浆中的酸性磷酸酶活性范围U/L，血清中酸性磷酸酶的活性范围在U/L，精液(semen)中含有高浓度的酸性磷酸酯酶，活力可以达到KU/L。 组织或植物粗酶液获得率(ml)=上清液体积(ml)/组织或植物质量×100% 注意事项： 1、 待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。 2、 建议每次测定时都做标准曲线，以使标准更准确，另外标准品需避免反复冻融。 3、 如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色杯的最小检测体积，尽量采用小体积的比色杯。 4、 所测样本的值高于标准曲线的上限，应用ACP Ass