质粒的提取及鉴定.pptxVIP

实验六质粒DNA的少量提取及鉴定天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系辛灵彪第一页，共四十七页。目的要求了解质粒的概念。熟悉提取质粒的基本原理。掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。第二页，共四十七页。1.关于质粒的概念a.什么是质粒（plasmid）？b.质粒的本质是什么？c.质粒有哪些构型？c.质粒有哪些特点？d.质粒的用途有哪些？第三页，共四十七页。质粒的定义 质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。 第四页，共四十七页。质粒的三种构型超螺旋DNA (supercoiled DNA, SC DNA)线状DNA (linear DNA, L DNA): 如果两条链均断开，即为线状DNA。（3）开环DNA (open circular DNA, OC DNA) 如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。第五页，共四十七页。质粒DNA的一般特性：(1)宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多(2)它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。(3)质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。(4)它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型：菌毛、抗药性等 第六页，共四十七页。2 提取大肠杆菌质粒DNA的方法和原则分离纯化质粒DNA的主要步骤(1)培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择）(2)细菌的收集与裂解 收集方法：高速离心的方法裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、 碱变性法、沸水 热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。 根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的 纯化方法等因素综合后加以选择。 (3)质粒DNA的纯化 常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较 小及共价闭合环状的性质。 第七页，共四十七页。原理示意图第八页，共四十七页。高酸中和至中性变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中实验原理：细菌的细胞壁破裂，内容物释放①染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA；②线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。高碱①质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状；②双链DNA并不完全分离。纯化RNA酶消化除去RNA，并用除去残留的蛋白质第九页，共四十七页。试剂盒主要试剂及作用溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris?HCl组成.(保护、缓冲)①葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械 剪切作用,防止破坏质粒. (保护作用)②EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对质粒分子的降解作用。（保护作用）③ Tris?HCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）第十页，共四十七页。试剂盒主要试剂及作用 溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性)① SDS是离子型表面活性剂,其主要作用是：溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；使蛋白质变性而沉淀下来。SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便后续更好地进行。② NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）可瞬间溶解细胞及细菌。第十一页，共四十七页。试剂盒主要试剂及作用溶液III：pH4.8 KAC(乙酸钾) 高盐溶液，pH调至中性 (复性，分离)①中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。第十二页，共四十七页。吸附株纯化质粒DNA第十三页，共四十七页。实验步骤1.收集4.5ml菌液于EP管，每次12000g×30s?2.弃上清，加含Rnase A溶液I 250 μl ，剧烈振荡3.加250μl 溶液II，快速颠倒数次?4.加350μl 溶液III，温和振荡10s，12000g×10min5.转移500μl上清到吸附株，12000g×1min?6.吸附柱中加700μl漂洗液，12000g×1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。7.向吸附柱中加入500μl漂洗液，12000g×1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 12000g×2min，8.将吸附柱敞口置于室温放置2min，挥发残余的乙醇。9.将吸附柱放入一个干净的EP管中，向吸附膜中央悬空滴加50μl经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000g×1min。10.将此质粒DNA溶液置于-20℃保存。第十四页，共四十七页。3、质