第三章基因工程的酶学基础.ppt

第六十二页，共一百一十一页。 DNA接头连接法 go 第六十三页，共一百一十一页。 第三节、DNA聚合酶 第六十四页，共一百一十一页。 一、大肠杆菌DNA聚合酶、 二、大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片断酶、 三、T4DNA聚合酶、 四、T7DNA聚合酶、 五、反转录酶等。 常用的DNA聚合酶 第六十五页，共一百一十一页。 共同点： 把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。 第六十六页，共一百一十一页。 一、大肠杆菌DNA聚合酶 DNA聚合酶Ｉ（PolＩ）、 DNA聚合酶Ⅱ（Pol Ⅱ）、 DNA聚合酶Ⅲ （Pol Ⅲ ）、 PolＩ和Pol Ⅱ 的主要功能参与DNA的合成； PolⅢ的功能同DNA的复制有关； PolＩ同DNA分子克隆的关系最为密切。 第六十七页，共一百一十一页。 1957年，美国的生物学家A.Kornberg首次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种DNA聚合酶，即现在所说的DNA聚合酶Ｉ。由polＩ基因编码的一种单链多肽蛋白质，分子量为109×103dal。 1. 大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ DNA聚合酶Ｉ，可以被蛋白酶切割成两个片断，一个具有全部的3’ 5’的外切酶活性和5’ 3’ 的聚合酶活性，另一个具有全部5’ 3’的外切酶活性。 第六十八页，共一百一十一页。 1)底物：四种脱氧核苷5’-三磷酸（dNTP）； 2)Mg＋＋离子； 3)带有3’-OH游离基团的引物链； 4)DNA模板：单链，双链（糖-磷酸主键上有一个或多个断裂）。 2.DNA聚合酶Ｉ发挥作用的条件： 第六十九页，共一百一十一页。 3. DNA聚合酶Ｉ5’ 3’的核酸外切酶活性 1) 5’ 3’的外切酶活性，所切割的DNA链必须是位于双螺旋的区段上； 2) 切割部位可以是末端磷酸二酯键，也可以是在距5’末端数个核苷酸远的一个键上发生； 3) DNA的合成可以增强5’ 3’的核酸外切酶活性； 4) 5’ 3’核酸外切酶的活性位点同聚合作用的活性位点以及3’ 5’的水解作用位点是分开的。 第七十页，共一百一十一页。 第七十一页，共一百一十一页。 能催化DNA链发生水解作用，从DNA链3’-OH末端开始向5’的方向水解DNA，并释放出单核苷酸分子。 对酶活的影响： 反应物中缺乏dNTPs时，大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的3’ 5’核酸外切酶活性，将会发挥作用。但对于底物是双链的DNA，在具有dNTPs时，这种降解活性将会被5’ 3’的聚合酶活性所抑制。 4. DNA聚合酶Ｉ的3’ 5’核酸外切酶活性 第七十二页，共一百一十一页。 第七十三页，共一百一十一页。 通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针 DNA缺口转移（nick translation nick translation ） 在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶Ｉ的5’ 3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5’一侧移去一个5’核苷酸之后，聚合酶作用就会在缺口的3’一侧补上一个新的核苷酸，但polＩ不能在3’-OH和5’-P之间形成一个键，随着5’一侧的核苷酸不断移去， 3’一侧的核苷酸又按序列增补，缺口便沿着DNA分子合成的方向移动 5 .DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途： 第七十四页，共一百一十一页。 第七十五页，共一百一十一页。 典型的反应体系是。在25μl总体积中含有1μg纯化的特定DNA片断，并加入适量的DnaseＩ、PolＩ、α-32p-dNTPs和未标记的dNTPs。 DnaseＩ： 造成DNA分子的断裂或缺口； PolＩ ： 进行缺口转移，使反应混合物中的32p标记的核苷酸取代原有的未标记的核苷酸，最终从头到尾都被标记。 DNA杂交探针的制备 第七十六页，共一百一十一页。 第七十七页，共一百一十一页。 在低浓度dNTPs的条件下， PolＩ具有良好的活性，提高dNTPs浓度时， PolＩ则能够更有效的合成DNA。 低浓度的 32p-dNTPs（2μmol/L）和高浓度的dNTPs（ 20μmol/L ） 一般希望有30%左