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γ-银环蛇毒素的重组表达及活性研究 摘要 α- α-BGT β- β-BGT 银环蛇毒素主要包含了 银环蛇毒素 （ ）、 银环蛇毒素 （ ）、 γ-银环蛇毒素 （γ-BGT）、κ-银环蛇毒素 （κ-BGT）。其中γ-BGT 在银环蛇粗毒中所 占比例极低，因此较难通过分离纯化的方式获得。γ-BGT 的作用机制和生理功能还 未完全阐明，但目前有研究发现它具有一些独特的生物学功能，突出了它的重要性。 本项研究通过构建pMAL-c5x 无标签蛋白表达载体重组表达了γ-BGT，表达的 γ-BGT 不带蛋白标签，通过G-75凝胶过滤层析、阳离子交换层析、高压液相色谱层 析成功分离纯化出有活性的重组表达的γ-BGT，经质谱鉴定分子量为7524.3Da，产 量约为200 μg/L，为γ-BGT 的功能研究提供了基础。质谱成像结果显示，重组表达 的γ-BGT 会引起小鼠大脑各部位蛋白质表达谱的变化。另外，重组表达的γ-BGT 使 人胶质瘤细胞U251细胞产生的外泌体增加，这可能是γ-BGT 透过血脑屏障后作用于 靶细胞的方式。 γ-银环蛇毒素结构包括三个loop，其中loop Ⅱ含有RGD 肽 （Arg-Gly-Asp）这 是其它三种银环蛇毒素所没有的。我们化学合成了loop Ⅱ，血小板聚集实验表明loop Ⅱ具有抗胶原激活的血小板聚集活性；血栓弹力图提示loop Ⅱ有抗凝功能；在三氯化 铁诱导的小鼠颈动脉血栓实验中loop Ⅱ对血栓的形成没有影响。 关键词：银环蛇；γ-银环蛇毒素；原核表达；RGD 肽；血栓 VI 第一章 前言 1动物毒素 毒液系统是有毒动物的一种特殊结构，在动物体内进化了无数次。其中毒液 混( 合毒素)通常储存在腺体和一个专门的输送系统中。动物的毒液有多种功能，最常见 的三种用途是掠夺或获取资源、防御和减少竞争。 [1][2] 捕食动物毒液的进化被认为是典型的捕食性适应 。首先，动物选择有利于快 速起作用并直接影响机动性和协调性的毒液。出于这个原因，许多类型的毒液都含 有神经毒性成分它们会扰乱神经或肌肉中的信息传递例如银环蛇毒素。 尽管在现阶段，人类一般既不是有毒动物的猎物，也不是捕食者。但在进化过 程中，人类和动物毒素的祖先在进化保守和相互作用方面紧密联系在一起。动物毒 素与人类的天然联系和内在联系是由动物毒素的来源、生物学相关性和生化特性决 定的。每年全世界都报告了大量的中毒事件导致了较大的发病率和死亡率，并已成 [3][4] 为一个严重的全球公共卫生问题 。据估计，地球上有超过22 万种有毒物种，约 占现存动物生物多样性的15%[5]，分布在环节动物、节肢动物、蛇类、软体动物、线 [6-8] 虫、海胆、海星等无脊椎动物，以及蛇、蜥蜴、鱼、地鼠和鸭嘴兽等脊椎动物 。 [9][10] 毒液是盐、小分子、多肽和蛋白质组成的复杂混合物 ，仅蜘蛛毒液中估计就有 2000 [11] 万种化合物 。这些化合物大多是毒素，其定义是对生物体造成剂量依赖性的 [12] 病理生理损伤，从而降低其生存能力的物质 。 对于动物毒素的研究可能会为人类疾病提供新的思路和见解，其中一些甚至可 能具有治疗作用。例如利用动物毒素发现新的镇痛靶点，开发镇痛药物，目前已经 从蜈蚣毒素、蜘蛛毒素、芋螺毒素、蛇毒中分离纯化出有镇痛活性的多肽。从少棘 蜈蚣毒液分离出的多肽具有镇痛作用，其机制是通过阻断NAV1.7 发挥镇痛作用，且 [13] 没有明显