WB实验常见问题与解决方案讲座.ppt

四、WB检测过程中常见问题的分析和解决方案——转膜问题 问题：转膜强度太强，导致目的位置上方的杂带太强 解决：降低转膜强度（时间和电流），使目标蛋白上方的蛋白少转移到膜上。 问题：泳道部分弯曲； 解决：可能是电泳槽问题；可能是8%以下的分离胶造成胶乱，转膜时，胶被扭曲。 四、WB检测过程中常见问题的分析和解决方案——胶的问题 问题：转膜气泡； 解决：制作三明治的时候注意（不在目的位置不影响，在目的位置只能重新做） 四、WB检测过程中常见问题的分析和解决方案——转膜问题 解决：转膜过程中，三明治制作仔细一点，转膜缓冲液没过转膜三明治。 四、WB检测过程中常见问题的分析和解决方案——转膜问题 四、WB检测过程中常见问题的分析和解决方案——二抗选择问题 问题：二抗选择问题； 解决：如果这种按膜还在，没有干过，用1XTBST洗涤5’X3次，然后从封闭开始，重新WB接下去的步骤。 1:500 1:1000 四、WB检测过程中常见问题的分析和解决方案——抗体稀释度 问题：杂带多，背景大； 解决：降低上样量，增加一抗的稀释比。 1~4：human cell 5：mouse cell 6：Rat cell 四、WB检测过程中常见问题的分析和解决方案——种属特异性 问题：大小鼠种属检测不到条带或者条带很弱； 解决：更换抗体，或者通过降低一抗稀释比和上样量等方法。 四、WB检测过程中常见问题的分析和解决方案——趋势问题 问题：抗体效价太高，趋势分不清 解决：增加一抗的稀释比 1:5000 内参 四、WB检测过程中常见问题的分析和解决方案——抗体一起孵育 内参 目的抗体 AKT ACTIN 典型胶片曝光 胶片曝光 正常胶片 四、WB检测过程中常见问题的分析和解决方案——胶片曝光 问题：胶片曝光； 解决：解决唯一的办法换没有曝光个的胶片；提前去掉曝光的胶片 四、WB检测过程中常见问题的分析和解决方案——ECL液的选择 BS7004： 问题：显色条带弱； 解决：可以选择超敏的发光液进行显色。 标准的ECL 超敏的ECL 四、WB检测过程中常见问题的分析和解决方案——曝光问题 问题：条带中间显白； 解决：增加ECL的稀释度，减少上样量，增加一抗的稀释度。 同一张膜上，相同的两个重复结果 ECL混匀浸润直接曝光 ECL混匀浸润十分钟后曝光 ECL混匀浸润十分钟后曝光 3s 120s 120s ECL混匀浸润直接曝光 ECL混匀浸润十分钟后曝光 ECL混匀浸润十分钟后曝光 ECL混匀浸润直接曝光 ECL混匀浸润十分钟后曝光 3s 四、WB检测过程中常见问题的分析和解决方案——ECL液问题 ECL混匀浸润十分钟后曝光 ECL混匀浸润直接曝光 ECL混匀浸润十分钟后曝光 ECL混匀浸润十分钟后曝光 ECL混匀浸润直接曝光 ECL混匀浸润十分钟后曝光 普通ECL液 超敏ECL液 问题：ECL显色过程中荧光淬灭过快； 解决：根据ECL液的特性，尽快选择显色（有些ECL液需要混匀孵育几分钟后才能达到最优的效果） Western blot常见问题及对策 一、WB基本原理的理解 蛋白质印迹的发明者 ：一般认为是上个世纪是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克(George Stark) 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot ：首次在尼尔·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)中首次被称为Western Blot 。 应用：广泛用于检测蛋白水平的表达 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot 的起源： Western Blot（WB）原理： 一、WB基本原理的理解 通过电泳区分不同组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的WESTERN 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1~5ng（最低可到10~100pg）中等大小的靶蛋白。 一、WB基本原理的理解 WB基本原理示意图 红色箭头：目标抗原 绿色箭头：靶抗体 黄色箭头：标记二抗 一、WB基本原理的理解 WB基本过程示意图 蛋白位置? 推荐样本裂解buffer 全细胞 NP-40 or RIPA 胞浆（可溶性蛋白） Tris-HCl 胞浆（骨架结合蛋白） Tris-Triton 膜蛋白 NP-40 or RIPA 核蛋白 RIPA or 核蛋白提取试剂盒 线粒体蛋白 RIPA or 线粒体分离试剂盒 WB样本来源：大部分细胞或组织裂解物 二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备 Triton-X100，NP-40，SDS和脱氧胆酸钠? 试剂名称? 作用推荐 Triton-X100 非离子表面活