人民医院基因扩增实验室EB病毒核酸定量检测标准操作程序(1).pdfVIP

人民医院基因扩增实验室EB病毒核酸定量检测标准操作程序 1 项目名称 单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测 2 检验方法名称 TaqMan 荧光定量检测 3 方法学原理 用一对EB 病毒特异性引物和一条EB 病毒特异性荧光探针， 该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和 一个荧光淬灭基团 （Q ）。探针完整时，R 基团发射的荧光信号被 Q 基团吸收；PCR 扩增时，Taq酶的 5’-3’外切酶活性将探针 酶切降解，使R 荧光基团和Q 荧光基团分离，Q 基团对R 基团 的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R 基团的荧光信 号。每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成。被切割产生 的荧光分子数与 PCR 产物的数量成比例，这样就实现了荧光信 号的累积与PCR 产物形成完全同步。因此根据PCR 反应液的荧 光强度即可计算出初始模板的数量。 4 标本要求 4.1 适用标本类型：全血。 4.2 标本采集 a ) 全血：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2 毫升，注 入含 EDTA （乙二胺四乙酸二钠）或枸橼酸钠抗凝剂的玻 璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5～10 次，使抗凝剂与静 脉血充分混匀，密闭送检。 5 试剂 5.1 试剂名称：EB 病毒病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光 探针法） 5.2 生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司； 5.3 试剂货号：#DA-B065 ； 5.4 包装规格：20 人份/盒； 5.5 试剂成份： 组成部分 数量 DNA 提取液（500µl/管） 2 管 CT PCR 反应液（400µ l/管） 2 管 Taq 酶（60µl/管） 1 管 EBV 阴性质控品（150µl/管） 1 管 EBV 强阳性质控品（200µl/管） 1 管 EBV 临界阳性质控品（200µl/管） 1 管 4 EBV 阳性定量参考品（1.0×10 基因拷贝/ml ） 1 管 10µl/管 5 EBV 阳性定量参考品（1.0×10 基因拷贝/ml ） 1 管 组成部分 数量 10µl/管 6 EBV 阳性定量参考品（1.0×10 基因拷贝/ml ） 1 管 10µl/管 7 EBV 阳性定量参考品（1.0×10 基因拷贝/ml ） 1 管 10µl/管 5.6 试剂储存条件：保存于—20 ℃，有效期6 个月。 6 仪器 ABI 7500 全自动基因扩增检测仪 7 操作步骤 7.1 DNA 提取 7.1.1 阴性质控品处理 a ) 取出阴性质控品，8,000rpm离心数秒，吸50μ l至0.5ml 灭菌离心管中，加入50μ lDNA提取液充分混匀，100℃恒 温处理10±1分钟； b ) 12000r/min 离心5min，备用。 7.1.2 标本处理 7