DB33_T 2247-2020鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法.docx

ICS 65.020.30 B 43 DB33 浙 江 省 地 方 标 准 DB33/T 2247—2020 鸭坦布苏病毒 RT-PCR 和实时荧光定量RT-PCR 检测方法 Method of RT-PCR and the real-time RT-PCR for the detection of duck tembusu virus disease 2020 - 03 - 03 发布 2020 - 04 - 03 实施 浙江省市场监督管理局 发 布 DB33/T 2247 DB33/T 2247—2020 I I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则编写。本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心、浙江省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：云涛、徐辉、周彩琴、张存、赵灵燕、余斌、吴赟竑、张传亮、吴雪军、黄晓兵、冯肖肖、华炯钢、吕见涛、张娟敏、鲍伟华。 PAGE PAGE 1 鸭坦布苏病毒 RT-PCR 和实时荧光定量 RT-PCR 检测方法 范围 本标准规定了鸭坦布苏病毒的反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和实时荧光定量RT-PCR的实验条件、操作步骤和结果判定等要求。 本标准适用于鸭坦布苏病毒核酸的检测。 术语和定义2.1 鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu Virus，DTMUV） 属于黄病毒科、黄病毒属、蚊媒病毒类、Ntaya病毒群，可引起鸭、鹅产蛋下降，雏鸭、雏鹅发病死亡。 实验条件 主要仪器设备 PCR 仪。 荧光定量 PCR 仪。 微量移液器。 组织匀浆器。 电泳仪。 电泳槽。 水浴锅。 紫外凝胶成像系统。 高速台式低温离心机。 生物安全柜。 试剂 0.01M 磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH7.4 PBS）：称取 8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.9 g Na2HPO4?12H2O、 0.2 g KH2PO4，将上述试剂溶于 800 mL 去离子水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将 pH 调节至 7.4，然后加去离子水定容至 1 L，高温灭菌 30 min，室温保存。 氯仿。 异丙醇。 焦炭酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌去离子水：用 DEPC 50 μL，加超纯水至 100 mL，室温过夜， 121℃高压灭菌 15 min，分装到 1.5 mL DEPC 处理过的离心管，冻存备用。 75%乙醇：取新开启的无水乙醇 75 mL，加 DEPC 水至 100 mL，混匀，-20℃预冷。 溴化乙锭 （EB）：取 1.0 g 溴化乙锭，加去离子水，定容至 100 mL。充分溶解后的溴乙锭溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存，其工作浓度为 0.5 μg /mL。 1×TAE 缓冲液：取 242 g 羟基甲基氨基甲烷（Tris）、37.2 g 二水乙二铵四乙酸二钠、57.1 mL 冰乙酸，加去离子水定容至 1 L，配置成 50×TAE 电泳缓冲液；量取 20 mL 的 50×TAE 电泳缓冲液，加入去离子水定容至 1 L，室温保存。 1%琼脂糖凝胶：称取 1.0 g 琼脂糖，加入 1×TAE 电泳缓冲液 100 mL，轻轻混匀后加热，使琼脂糖完全熔化。待琼脂糖胶冷至 50℃～60℃时，加 EB 溶液（终浓度 0.5 μg/mL）或 5 μL 核酸染料，摇匀后倒入制胶板中，厚度为 3 mm～5 mm，室温凝固后取下电泳梳子，备用。 DNA 相对分子质量标准物 Marker：DL 2000。 10×加样缓冲液：称取 25 g 聚蔗糖、0.1 g 溴酚蓝、0.1 g 二甲苯青，加入灭菌双蒸水定容至 100 mL。 商品化的一步法实时荧光 RT-PCR 反应试剂盒。One Step Prime Script? RT-PCR Kit（Perfect Real Time，TAKARA)，含有 RT-PCR 缓冲液，酶混合物，dNTP 混合物，无 RNA 酶的水等。 M-MLV 反转录酶。 RNA 酶抑制剂。 TaqDNA 聚合酶。 dNTPs。 引物：RT-PCR 扩增引物,见表 1；实时荧光定量 RT-PCR 引物和探针，见表 2。 表1 RT-PCR 扩增引物 引物名称 引物序列 DTMUV引物P1 5- GCAACCAGGCAAAGAGGTCATA -3 DTMUV引物P2 5- AAGTGAGCCTCATCCATAATGAACA -3 表2 实时荧光定量 RT-PCR 引物和探针 引物名称 引物序列(5-3) DTMUV 引物 P3 AAGTCAGGCCAGGGAATCC DTMUV 引物 P4 CATGCACCCAGATTTGTTAACC DTMUV探针 FAM-CCGTCATCCAAC