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ICS 65.020.30 B41
DB33
浙 江 省 地 方 标 准
DB33/T 2254—2020
猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒双重荧光定量 RT-PCR 检测方法
Method of duplex fluorescence quantitative RT-PCR for the detection of porcine epidemic diazhangchenrrhea virus and transmissible
gastroenteritis virus
2020 - 04 - 08 发布 2020 - 05 - 08 实施
浙江省市场监督管理局 发 布
DB33/T 2254
DB33/T 2254—2020
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前 言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由浙江省农业农村厅提出。
本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。本标准起草单位:浙江农林大学。
本标准主要起草人:宋厚辉、邵春艳、王晓杜、孙静、姜胜、周莹珊、杨永春、程昌勇、章先、杨杨、卫芳芳。
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猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒双重荧光定量 RT-PCR 检测方法
范围
本标准规定了猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)双重荧光定量RT-PCR检测方法的材料准备、样品采集、核酸提取、荧光定量RT-PCR检测及结果判定。
本标准适用于猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的核酸检测。
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法
缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Ct值:达到阈值的循环数(Cycle threshold) DEPC:焦磷酸二乙酯(Diethylpyrocarbonate) DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid) PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline)
PEDV:猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus) RNA:核糖核酸(Ribonucleic Acid)
RT-PCR:逆转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) TGEV:猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus)
试剂和材料
除非另有说明,所用试剂均为分析纯;所有试剂均用无 RNA 酶的容器分装。0.01 mol/L PBS 和 DEPC 水配制中所使用的水应符合 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法中一级水的要求。
Trizol:RNA 抽提试剂,2 ℃~8 ℃保存。
4.3 氯仿:2 ℃~8 ℃预冷。
异丙醇:2 ℃~8 ℃预冷。
75%乙醇:用新开启的无水乙醇和 DEPC 水配制,2 ℃~8 ℃预冷。
DEPC 水:配置方法见附录 A。宜直接购买商品化 DEPC 处理的无 DNA 酶和 RNA 酶的水。
0.01 mol/L PBS,pH7.2:配制方法见附录 A。
2×One Step RT-PCR buffer(内含 PCR buffer、dNTPs 和 Mg2+)。
DNA 聚合酶:HS Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)。
反转录酶预混物(内含 RNase 抑制剂)。
阳性对照:猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎灭活病毒混合物。
阴性对照:DEPC 水。
用于 RT-PCR 反应的引物浓度为 10 μmol/L,探针浓度 10 μmol/L,其序列分别为: PEDV 上游引物 F:5’-GCTTGCTTCGGACCCAGAGG -3’;
PEDV 下游引物 R:5’-ACGAACAGCCACATTACCACCAA -3’;
PEDV 探针 P:5’-TTGGAGATGCGGAATTTGTCGAA-3’,其 5’端和 3’端分别标记 FAM 和 MGB; TGEV 上游引物 F:5’-AAGGAAGATGGCGACCAGATAG-3’;
TGEV 下游引物 R:5’-CACTTCTGATGGGCGAGCAT -
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