DB33_T 2246-2020猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量RT－PCR检测方法.docx

ICS 65.020.20 B 44 DB33 浙 江 省 地 方 标 准 DB33/T 2246—2020 猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量RT －PCR 检测方法 Real-time PCR detection technique for Japanese encephalitis virus 2020 - 03 - 03 发布 2020 - 04 - 03 实施 浙江省市场监督管理局 发 布 DB33/T 2246 DB33/T 2246—2020 I I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009的规定编写。本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：谢荣辉、张传亮、吴赟竑、徐辉、刘霞、周蕾、柴娟、虞一聪、王雅婷、周彩琴、赵灵燕、刘爱军、吴雪军。 PAGE PAGE 1 猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量 RT－PCR 检测方法 范围 本标准规定了猪流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）荧光定量RT－PCR检测的实验条件、操作步骤和结果判定等要求。 本标准适用于猪流行性乙型脑炎病毒核酸的检测。 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 猪流行性乙型脑炎 由猪流行性乙型脑炎病毒引起的一种急性传染病。猪的主要临床症状表现为高热、流产、死胎和公猪睾丸炎。 实验条件 仪器 高速冷冻离心机。 荧光定量 PCR 仪。 生物安全柜。 组织研磨仪。 微量移液器。 冰箱。 涡旋混匀器。 高压灭菌器。 试剂 除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器分装。 Trizol：核糖核酸（Ribonucleic acid, RNA）提取试剂。 氯仿：4 ℃预冷。 异丙醇：4 ℃预冷。 焦炭酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate ,DEPC）水：取 DEPC 100 μL，加超纯水至 100 mL，室温过夜，121 ℃高压灭菌 15 min，分装，冻存备用。 75%乙醇：用 75 mL 无水乙醇，加 DEPC 水至 100 mL，混匀，－20 ℃预冷。 商品化的一步法实时荧光 RT-PCR 反应试剂：One Step Prime Script? RT-PCR Kit（Perfect Real Time，TAKARA)，含有 2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ、Ex Taq HS（5 U/ μL）、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ和无 RNA 酶的水。 0.01mol/L PH7.4 磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline,PBS）：取 Na2HPO4.12H2O 2.9g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g, NaCl 8g, 溶于 800 mL 去离子水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将 pH 调节至7.4，然后加去离子水定容至 1 L，高温灭菌 30 min，室温保存。 引物和探针，其序列如下：上游引物：5－GGCTCTTATCACGTTCTTCAAGTTT-3，下游引物：5－ TGCTTTCCATCGGCCYAAAA-3，探针：5－FAM-AGCATTAGCCCCGACCAAGGCG-TAMRA-3。 阳性对照：猪乙型脑炎活疫苗（SA14-14-2 株）。 操作步骤 样品采集 脑组织：选择代表性病症的病死猪，应无菌采集脑组织，将采集到的脑组织装入到无菌离心管中并编号，冷藏送检或-20 ℃以下保存备用。 全血：用无菌注射器耳静脉采集猪血，将采集到的猪血装入到无菌离心管中并编号，冷藏送检。若不能及时送检的全血，应分离血清置于-20 ℃以下保存备用。 样品处理 取待检脑组织适量装入到无菌离心管中，按 1：10 体积加入 PBS，置于组织研磨仪中充分研磨。将研磨后的样品，反复冻融 3 次，10000 r/min 离心 5 min，取上清液至无菌离心管中，编号待检。 取全血 3500 r/min 离心 5 min，取血清至无菌离心管中，编号待检。 RNA 提取 按下列步骤完成 RNA 提取，也可采用商品化的病毒 RNA 提取试剂盒。 取 n 个灭菌的 1.5mL 离心管，其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，对每个离心管进行编号。 每管加入 750 μL Trizol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各 250ul,震荡数次，静置5 min。再加入 200 μL 预冷的氯仿，震荡混匀，静置 5 min，于 4 °C 12 000 r/min 离心 15 min。 取与本标准 5.3.2 中相同数量的灭菌 1.5ml 离心管，并对每个离心管进行编号。取本标准 5.3.3 中离心