临床基因扩增检验在性病实验诊断中的应用知识讲座课件.pptx

临床基因扩增检验技术在性病实验诊断中的应用;;1985年，Kary.B.Mullis教授发明了具有划时代意义的PCR技术。 1993年， Kary.B.Mullis因该技术的发明而获得诺贝尔化学奖。;PCR反应过程;;PCR产物的电泳检测和分析;二、实时荧光定量PCR (Real time Quantitative PCR);TaqMan作用机理;普通PCR;实时荧光定量PCR应用;三、实时荧光定量PCR结果分析;PCR扩增曲线线性图;;结果分析时的几个基本概念;基线;阈值线;Ct值;监测核酸提取、扩增及产物分析的有效性—弱阳性/阳性质控品 监控核酸提取过程中是否发生污染、试??是否存在污染—阴性质控品 ;阳性质控或者样本没有典型的扩增； 阳性质控Ct值或者定值偏差在±2SD之外 阳性质控或者样本扩增曲线异常，不呈典型的“S”型，如直线倾斜扩增或者折线型； ;失控的一般情况;失控的一般情况;失控的一般情况;失控的一般情况;假阳性的控制—UNG酶+dUTP防污染体系;假阴性的控制—内标;四、结果报告的要点分析;报告的基本要求;IU与拷贝;五、临床基因扩增检验技术在性病实验诊断中的应用;标本采集、存放及运输;对于常规开展的项目应该定期进行室内质量控制。 定量与定性 ;病原微生物如淋球菌等经药物治疗后已死亡，但PCR仍可为阳性，故治疗结束后至少两周内不宜做PCR检测。 ; 定性项目不能发定量报告 分泌物（拭子）样本;六、临床基因扩增检验管理;一、临床基因扩增检验实验室的设计 ??? （一）临床基因扩增检验实验室区域设计原则。原则上临床基因扩增检验实验室应当设置以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。这4个区域在物理空间上必须是完全相互独立的，各区域无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。根据使用仪器的功能，区域可适当合并。例如使用实时荧光PCR仪，扩增区、扩增产物分析区可合并；采用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并。 各区的功能是： ??? 1.试剂储存和准备区：贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备，以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。??? 2. 。标本制备区：核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管。对于涉及临床样本的操作，应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。??? 3.扩增区：cDNA合成、DNA扩增及检测。??? 4.扩增产物分析区：扩增片段的进一步分析测定，如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等 ;（二）临床基因扩增检验实验室的空气流向。 临床基因扩增检验实验室的空气流向可按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区进行，防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。可按照从试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。可通过安装排风扇、负压排风装置或其他可行的方式实现。 ;（三）工作区域仪器设备配置标准。;二、临床基因扩增检验实验室工作基本原则 ??? (一)进入各工作区域应当严格按照单一方向进行，即试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→ 扩增产物分析区。 ??? (二)各工作区域必须有明确的标记，不同工作区域内的设备、物品不得混用。 ??? (三)不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。 ??? (四)实验室的清洁应当按试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应当有其各自的清洁用具以防止交叉污染。 ??? (五)工作结束后，必须立即对工作区进行清洁。工作区的实验台表面应当可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应当方便有效。由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯（254nm波长），在工作完成后调至实验台上60～90cm内照射。由于扩增产物仅几百或几十碱基对（bp），对紫外线损伤不敏感，因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间，最好是照射过夜。 ??? (六)实验室的安全工作制度或安全标准操作程序，所有操作符合《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。;三、临床基因扩增检验实验室各区域工作注意事项 ??? (一)试剂储存和准备区。贮存试剂和用于标本制备的消耗品等材料应当直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过扩增检测区，试剂盒中的阳性对照品及质控品不应当保存在该区，应当保存在标本处理区。? ??? (二)标本制备区。由于在样本混合、核酸纯化过程中可能会发生气溶胶所致的污染，可通过在本区内设立正压条件，避免从邻近区进入本区的气溶胶污