elisa检测技术学习.pptx

第1页/共25页酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验( Enzyme-Linked Immunosorbent Test, ELISA ) ： 基于抗原-抗体反应的特异性和等比例性，是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附（包被）在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板，也称酶标板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，加入相应的酶底物后发生颜色反应，通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，通过颜色反应的深浅检测标本中相应抗体或抗原含量的检测技术 。 第2页/共25页ELISA的发展概况 自从Engvall和Perlman（瑞典，1971）首次报道建立酶联免疫吸附试验（ELISA）以来，由于ELISA技术具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。 随着生物技术的快速发展，将利用基因工程技术制备的抗原或单克隆抗体包被酶标板后，极大地提高了ELISA检测技术的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。 目前，ELISA检测技术在科学研究、疾病诊断、检验检疫、环境监测等诸多领域广泛应用。第3页/共25页ELISA的基本原理基本原理 酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过分光光度计进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 第4页/共25页ELISA试剂盒的组成完整的ELISA试剂盒通常包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（俗称酶标板）；（2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）；（3）酶的底物；（4）参考标准品（定量试剂盒）及其稀释液；（5）酶标记物及样本的稀释液；（6）洗涤液（通常为浓缩液，用前按比例稀释）；（7）反应终止液；（8）封口膜若干、说明书一份。第5页/共25页酶标板第6页/共25页ELISA常用酶类辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)DH2+ H2O2 D + H2O　上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。常用底物： 1. 邻苯二胺(OPD)，产物为橙红色（492nm检测）； 2. 四甲基联苯胺(TMB)，产物为蓝色，酸性条件下变为 黄色（450nm检测）。反应终止液：HCl或H2SO4溶液。第7页/共25页碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)常用底物： 1. 对硝基苯磷酸酯 ( p-NPP )，产物为黄色的对硝基酚 （405nm检测）； 2. 发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于荧光测定，灵敏度高于显色底物的方法。反应终止液：NaOH 溶液。第8页/共25页ELISA所需仪器设备恒温箱洗板机酶标仪第9页/共25页ELISA的类型和方法直接法间接法双抗夹心法 (直接夹心法)试验性质双夹心法 (间接夹心法)BAS-ELISA竞争法ELISA半定量ELISA试验试验目的定量ELISA试验第10页/共25页直接法ELISA 直接法ELISA是将酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原-抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量（见后图） 。该方法可用于检测抗体或抗原。 优点: 1. 特异性高、准确性好； 2. 实验操作简便，用时短。缺点: 1. 应用范围较小，生产难度大。 ——需制备各种酶标抗原或抗体。第11页/共25页间接法ELISA 间接法ELISA是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结合形成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反映一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（见后图）。 该方法可用于抗体检测，是目前检测抗体最常用的ELISA方法。优点: 1. 适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体; 2. 制备方便，价格便宜。第12页/共25页双抗夹心法ELISA 双抗夹心法是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，在用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出捕获的抗原量，本方法也称为直接夹心法（见后图） 。 该方法可用于抗原检测，例如细胞因子、激素、蛋白质、细菌、病毒等，是目前