流式细胞检测技术讲座.ppt

FACSCanto光学滤片 检测器组 （激光器） PMT位置 带通/长通透镜 适用染料 八角形 （488nm蓝色激光） A 780/60 PE-Cy7 B 670 LP PerCP-Cy5.5, PerCP C 585/42 PE, PI D 530/30 FITC 三角形 （633nm红色激光） A 780/60 APC-Cy7 B 660/20 APC 第31页，共46页，2022年，5月20日，5点56分，星期五 FACSAria光学滤片 检测器排列 （激光器） 光电倍增管 BP滤光片 可用染料 八角形 （488nm蓝色激光） A 780/60 PE-Cy7 B 695/40 PerCP-Cy5.5, PerCP C 610/20 PE-Texas Red D 575/26 PE E 530/30 FITC 三角形 （633nm红色激光） A 780/60 APC-Cy7 B 660/20 APC 三角形 （407nm紫色激光） A 530/30 Alexa Fluor 430 B 450/40 Cascade Blue, Pacific Blue, DAPI, Hoechst, Alexa Fluor 405 第32页，共46页，2022年，5月20日，5点56分，星期五 荧光染色对照 阳性对照 使用已知阳性样本，帮助排除试剂的质量、浓度、特异性以及染色方法等因素 阴性对照 空白对照（自发荧光） 自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高，自发荧光越强。 实验样本（自发荧光＋特异荧光＋非特异荧光） 特异荧光，即抗体F(ab’)2段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光 非特异荧光，即抗体Fc段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光 同型对照（自发荧光＋非特异荧光） 第33页，共46页，2022年，5月20日，5点56分，星期五 同型对照 同型对照（Isotype Control） ： 与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型 与染色的单克隆抗体 ①相同种属来源 ②相同免疫球蛋白及亚型 ③相同荧光素标记 ④相同剂量和浓度 ⑤但由未免疫动物血清纯化而来 用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色 例如，标记FITC的单克隆抗体为小鼠IgG1亚类抗体，标记PE的单克隆抗体为小鼠IgG2a亚类抗体，同型对照应用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化IgG1（γ1）和IgG2a（ γ2a），并分别标记FITC和PE 第34页，共46页，2022年，5月20日，5点56分，星期五 关于流式细胞检测技术讲座 第1页，共46页，2022年，5月20日，5点56分，星期五 主要内容 流式细胞技术概念 流式细胞技术原理 流式实验的设计 流式细胞技术在临床科研上的应用 第2页，共46页，2022年，5月20日，5点56分，星期五 流式细胞技术概述 流式细胞技术的概念 流式细胞技术的特点 流式细胞仪的检测范围 BD公司流式细胞仪 流式细胞仪的结构 第3页，共46页，2022年，5月20日，5点56分，星期五 什么是 FCM ？ 流式细胞术：利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析及分选的技术 激光技术+流体力学+光电测量技术+计算机技术+细胞荧光化学技术+单克隆抗体技术 第4页，共46页，2022年，5月20日，5点56分，星期五 FCM的特点 测量速度快：最快可在1秒种内检测上万个细胞 可进行多参数测量：可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量 具有明显的统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况 高分辨率(CV2%)、高灵敏度(荧光检测灵敏度≤100MESF，前向角散射光检测灵敏度(0.2～0.5um) 既是细胞分析技术，又是精确的分选技术，分选纯度可达99%以上 第5页，共46页，2022年，5月20日，5点56分，星期五 流式细胞仪的检测范围 细胞结构 细胞大小 细胞颗粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 第6页，共46页，2022年，5月20日，5点56分，星期五 BD公司流式细胞仪 FACSCalibur LSRII FACSCanto FACSCount FACSVantage FACSAria 第7页，共46页，2022年，5