生化技术原理复习重点.docxVIP

■第三节细胞的破碎欲提取存在于细胞内的物质时，必须把细胞破碎。 ■动物一一细胞膜较脆弱极易破损，在组织绞碎或提取时就破坏了。 ■植物和微生物一一细胞壁较牢固，需要在提取前进行专门的破细胞操作。 一、机械破碎研磨法 1）用研磨棒研碎组织，可加入一定量的石英砂（45-50Rm）o2）匀浆器处理 优点：较温和，适宜实验室应用 注意：加石英砂时，对有效成分有吸附作用 细菌和植物组织的细胞破碎均可用此法组织捣碎器法 剧烈的破碎细胞方法。 在转速8000-10000 r / min下处理30-45秒，细胞能完全破碎。 注意： 1）加入石英砂； 2）必须保持低温，以防温度升高引起有效成分变性； 3）时间不易太长。 超声波法 ■它是借助声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。 ■加石英砂则可缩短时间。 ■为防止产生过多的热量，用间歇处理和降低温度的方法。 压榨法 ■此法是一种温和、彻底破碎细胞的方法。 ■用的压力迫使几十毫升细胞悬液通过一个小孔（V细胞直径的 孔），致使其被挤破、压碎。 冻融法 将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40°C左右）迅速融化。如此反 复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀、破碎。 二、溶胀和自溶溶胀 ■细胞膜为天然的半透膜，低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量 进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象称溶胀。 ■例如，红血球置清水中会迅速溶胀破裂并释放出血红素。 自溶■细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，发生溶解的现象称 自溶。 ■特别小心操作，水解酶不仅可使细胞壁、细胞膜破坏，也可把有效成分在白溶时分 解。 三、化学处理 用脂溶性的浴剂（如丙酮、氯仿、甲苯）或表面活性剂（SDS）处理细胞时，可把细胞壁、 细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类等物质，并导致整个细胞破碎。 四、生物酶降解 ■生物酶（如溶菌酶）有降解细菌细胞壁的功能。用此法处理细菌细胞时，先是细胞图3-4B 图3-4B加样操作示意图 图3-4B加样操作示意图1.平衡液流至固定相表面时，关闭柱下端螺旋夹；2.加样后，打开螺旋夹；3.样品液向固定相移动；4.样品液流至固定相表面时，关闭柱下端螺旋夹；5.用冼涤液冲洗柱壁后，打开螺旋夹；6.洗涤液流至固定相表面时，关闭柱下端螺旋夹；7 图3-4B加样操作示意图 ■ 同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集（按体积或时间分管 收集），随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。根据测定结果，即可绘制出洗 脱曲线（以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液中样品的浓度或活性为纵坐标）。 图中的A峰和B峰均呈对称形，二者没有重叠，这表明样品液中的组分己完全分 开。 定性定量洗脱物的依据：层析峰的面积（FEG）、峰高（BE）和半峰高宽度（HI）等 参数ve ve ve ve ■ 洗脱液的流速必须控制。如果太快，洗脱物在两相中的平衡过程不完全, 如果太慢，洗脱物会扩散。 ■由层析柱分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定。如杂质含量仍大时，应该用其它方法继续纯化。 ■层析柱的变化Bed height (cm) Flow rate(mL/cm2/h) 20 85 1 85 f 20 3025 25流 速； Elution time (h) 6S d SP0S8Ssa-dou _」d I col-c =e(L66 D D-3B 巨 Rud Eo^ PQ)一 dep00 基质的粗细对分辨率的影响 相对吸光度 500005000 2 0.51.0分离效果不好 溶液的体积范围 变大 分离效果最好1.5 .VeA/t. 5.吸附剂的再生 ■用过的吸附剂，经适当方法处理后，又恢复其性能的过程。 SPO￡8W 辱 SQ一 dou 一0:|§6含 一eBoemJgd Eo^ psdepv 一般不同吸附剂（或基质）的再生方法是不同的。 柱层析的操作原则Juang RH （2004） ECX 吸附剂的种类 使目标蛋白质较早分离出来 吸附剂的粗细 吸附剂越细，分离效果越好，但流速变慢 柱子大小 柱越长越好，但要考虑实际的应用目的 柱的形式 胶体过滤用细长型，其余用粗短型 填装紧密 吸附剂填装紧密，可以提高分离效率 柱子流速 流速太快，降低分离效率，太慢，样品扩散 样品体积 有一定的限制，体积太大，会降低分离效率 第四章离子交换层析■ 离子交换层析是一种常用的层析方法 它是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。 应用：很多生化物质（例如氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、核昔和有机酸等）的分 析、制备、纯化，以及溶液的中和、脱色等。 第一节基本原理离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。它在水中呈不溶解状态，能释放出反离子。 它将与溶液中的其它离子相