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整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 同源序列依赖型的体内重组：同源整合 ori 目的基因 同源区域 标记基因 整合位点 染色体DNA 第六十三页，共九十页。 包涵体型异源蛋白的表达 以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点 包涵体表达形式的缺点： 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30% 第三十一页，共九十页。 包涵体型异源蛋白的表达 以包涵体形式表达目的蛋白的操作 如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长处所在 第三十二页，共九十页。 包涵体型异源蛋白的表达 包涵体的变性与复性操作 C 共价修饰的蛋白质 蛋白质变性复性的动力学原理： C1 C2 Cn C U I 1 I n N X1 X2 Xn X Ag Ag Ag Ag I 有效变复性过程中的中间状态 X 脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态 N 天然状态的蛋白质 U 变性状态的蛋白质 A 集聚状态的蛋白质 在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为 无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人 工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作 第三十三页，共九十页。 包涵体型异源蛋白的表达 包涵体的变性与复性操作 包涵体的溶解与变性： 包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键 在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。能有效促进 包涵体溶解变性的试剂和条件包括： 清洗剂 SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化 促溶剂 盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发 形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应 混合溶剂 如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强 极端pH 廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应 第三十四页，共九十页。 包涵体型异源蛋白的表达 包涵体的变性与复性操作 包涵体的复性与重折叠（refolding）： 包涵体的复性与重折叠的主要任务是： 通过次级键的形成使蛋白质复性 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠 第三十五页，共九十页。 包涵体型异源蛋白的表达 包涵体的变性与复性操作 包涵体的复性与重折叠（refolding）：复性操作 包涵体复性操作的方法包括： 分段稀释法，逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生 一步稀释法，蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大 试剂添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+ 蛋白修饰法，氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚 产物隔离法，将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞 分子伴侣法，GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表达 第三十六页，共九十页。 包涵体型异源蛋白的表达 包涵体的变性与复性操作 包涵体的复性与重折叠（refolding）：二硫键形成 在包涵体变性体系中，始终存在着还原剂，使多肽链中的巯基保持还原状态，防 化学氧化法（A）需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成是 二硫键交换（B）需要还原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫键 止二硫键错配导致严重的集聚。在变性操作结束后，这些游离型的巯基必须重新 配对形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。形成二硫键的方式主要有： 随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠 形成相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好 HS HS S S + 2e + 2H+ A HS HS S-S-R HS + B R-S-S-R S S 2R-SH 第三十七页，共九十页。 分泌型异源蛋白的表达 在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件 第三十八页，共九十页。 分泌型异源蛋白的表达 以分泌形式表达目的蛋白的优缺点