实验大肠杆菌的分离和培养.pptVIP

实验1 大肠杆菌的培养和分离 基本要求 1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。 2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的培养。 第一页，共三十三页。 一、大肠杆菌 革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌 在肠道中一般对人无害 但也有一些菌株对人体是有害的，可侵袭肠粘膜并产生毒素 任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。 第二页，共三十三页。 结晶紫 碘液 95%乙醇 革兰氏染色法 1min 革兰阳性 革兰阴性 1min 脱色 复染 第三页，共三十三页。 菌落（colony）：一个细菌细胞在固体培养基上发展成一个肉眼可见，具一定形态结构的子细胞群。 光滑型菌落 粗糙型菌落 第四页，共三十三页。 第五页，共三十三页。 二、细菌的培养和分离 1、实验仪器设备： 移液枪 第六页，共三十三页。 接种环 玻璃刮刀 第七页，共三十三页。 超净工作台 （保证 无菌环境） 第八页，共三十三页。 高压蒸汽灭菌锅 第九页，共三十三页。 恒温培养箱 第十页，共三十三页。 摇 床 第十一页，共三十三页。 2、培养基： 平板 斜面 固体培养基 LB培养基： 蛋白胨：0.5g 酵母提取物：0.25g NaCl:0.5g H2O:50mL 琼脂：1g 液体培养基 固体培养基 调pH值 第十二页，共三十三页。 菌膜 菌沉淀 均匀浑浊 对照 液体培养基（培养液） 第十三页，共三十三页。 3、实验步骤： （1）培养基、培养皿灭菌 ——高压蒸汽灭菌法 将配制好的50ml LB液体和固体培养基 分别装入250ml 三角瓶中，加上封口膜； 将培养皿用牛皮纸包好； 置于灭菌锅内1kg压力灭菌15min （121℃） 第十四页，共三十三页。 无菌技术 最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。 有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞（不能用脱脂棉：易吸水引起后引起污染），也可采用各种金属、塑料、封口膜及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。 （160 ℃ 2h或170 ℃ 1h） 第十五页，共三十三页。 高压蒸汽灭菌法：玻璃器皿、金属、移液枪头等 （火焰）灼烧：接种环、试管口、三角烧瓶口 紫外灯+过滤风：超净台灭菌 消毒：70%酒精棉球 （消毒：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。） 第十六页，共三十三页。 （2）倒平板 灭菌后，待灭菌锅压力与大气压力相同时打开锅盖 将有培养基的三角瓶和培养皿放到超净台上 打开超净台的紫外灯和过滤风，待固体培养基冷却到60℃时，关闭紫外灯 用酒精棉球消毒桌面和手。 第十七页，共三十三页。 倒平板： 10-12ml培养基/培养皿每倒入一个后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，并形成平面。 酒精灯旁： 左手？右手？ 第十八页，共三十三页。 制作试管斜面： 将配制好的呈熔化状态的培养基转移到试管中时必须用三角漏斗 灭菌试管冷却到50℃左右， 把试管棉塞一端搁在玻棒上， 待冷凝后即成试管斜面 将分装好的含培养基的试管灭菌 P21小字部分 第十九页，共三十三页。 1/3在试管外， 2/3在试管内 正确 不正确 棉塞制作 第二十页，共三十三页。 （3）接种培养 左手：将大肠杆菌斜面和有液体培养基 的三角烧瓶，靠近酒精灯火焰； 右手：拿接种环，并用无名指和小指 夹住斜面的棉塞和三角瓶的封口膜； 接种环在火焰上烧红，再深入到斜面， 使环接触培养基，再取菌体； 将菌体放入三角瓶的液体培养基中， 瓶口封口膜和管口棉塞复原； 将三角瓶置于37℃摇床振荡培养12h。 第二十一页，共三十三页。 第二十二页，共三十三页。 （4）划线分离 在酒精灯火焰上灼烧接种环； 将摇床上培养了12h的菌液 打 开，接种环部分深入到菌液中； 在固体培养基的平板上连续划线，接种环只 在菌液中蘸菌液一次，划线后盖好培养皿； 将培养皿倒置（盖在下面），放到恒温培养箱中培养12-24h后，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。 第二十三页，共三十三页。 划线分离法 划线的起点要有菌，且每一次新的起点应比前一次的起点菌含量（浓度）低 划线的最终点不能与前面的划线点重叠 除第1次外，其余几次划线前，都要将接种环火焰灼烧 第二十四页，共三十三