蛋白质和氨基酸的测定.pptVIP

蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始计时 继续蒸馏10分钟后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min 用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。 第三十一页，共七十六页。 三、自动凯氏定氮法 1、? 原理及适用范围 同常量凯氏定氮法 2、? 主要仪器 自动凯氏定氮仪 消化装置 3、? 试剂 硫酸铜和硫酸钾制成片剂 第三十二页，共七十六页。 全自动凯氏定氮仪 第三十三页，共七十六页。 第三节??? 蛋白质的快速测定法 双缩脲法 紫外分光光度法 染料结合法 水杨酸比色法 第三十四页，共七十六页。 一、双缩脲法 1、原理 当脲小心地加热至150～160℃时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲（也叫双缩脲），反应式如下： 第三十五页，共七十六页。 双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应 第三十六页，共七十六页。 蛋白质分子含有肽键, 与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色配合物 在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量，该配合物的最大吸收波长为560nm。 第三十七页，共七十六页。 2、方法特点及应用范围 本法灵敏度低，但操作简单快速，故在生化领域中测定蛋白质含量时常用此法。 本法亦适用于豆类油料、米、谷等作物种子及肉类等样品测定。 3、? 主要仪器 4、? 试剂 （1）碱性硫酸铜溶液 ①??以甘油为稳定剂 ②??以酒石酸钾钠作稳定剂 配制试剂加入硫酸铜溶液时，必须剧烈搅拌，否则将生成氢氧化铜沉淀 （2）四氯化碳 第三十八页，共七十六页。 5、 操作方法 ①???? 标准曲线的绘制 凯氏定氮法测出的标准蛋白质样 显色（加入试剂静置1小时） 比色（取上清离心） ②???? 样品的测定 显色 比色 查标准曲线 第三十九页，共七十六页。 6、结果计算 蛋白质（mg/100g）= 式中：c—由标准曲线上查得的蛋白质mg数； m—样品质量，g 第四十页，共七十六页。 二、紫外分光光度法 1、? 原理 蛋白质及其降解物（眎、胨、肽和氨基酸）的芳香环残基 在紫外区内对一定波长的光具有选择吸收作用。在此波长（280nm）下，光吸收程度与蛋白质浓度(3～8mg/ml)成线性关系 第四十一页，共七十六页。 2、 适用范围 本法操作简便迅速，常用于生物化学研究工作， 许多非蛋白质成分在紫外区也有吸收作用，光散射作用的干扰， 在食品分析领域中的应用并不广泛，最早测定牛乳的蛋白质含量，也可测小麦面粉、糕点、豆类、蛋黄及肉制品中的蛋白质含量 第四十二页，共七十六页。 3、主要仪器 紫外分光光度计 离心机 4、试剂 1mol/L柠檬酸水溶液 8mol/L尿素的2mol/L氢氧化钠溶液 95%乙醇 无水乙醚 第四十三页，共七十六页。 5、操作方法 ①?标准曲线的绘制 ? 准确称取试样2.00g，+0.1mol/L 柠檬酸,四层纱布过滤，离心 上清液+脲的氢氧化钠溶液，至透明 比色，8mol/L脲的氢氧化钠溶液作参比 ②?样品的测定 第四十四页，共七十六页。 6、结果计算 蛋白质（mg/100g）= 中 c—由标准曲线上查得的蛋白质mg数； m—样品质量，g 第四十五页，共七十六页。 三、染料结合法 1、? 原理 ?凡是来源相同的蛋白质，碱性（或酸性）氨基酸的含量，大体上是相同的。利用这个特点，加入过量的酸性（或碱性）染料，使其和蛋白质形成不溶性盐而沉淀析出。用分光光度计测定未反应的染料量，然后根据算出来的结合染料量求出蛋白质含量。 第四十六页，共七十六页。 2、? 适用范围 本法适用于牛乳、冰淇淋、酪乳、巧克力饮料、脱脂乳粉等食品。 第四十七页，共七十六页。 3、? 主要仪器 分光光度计 组织捣碎机 离心机 第四十八页，共七十六页。 4、 试剂 5、 操作方法 (1)样品处理： （2）染料结合： （3） 过滤离心： （4）比色： 第四十九页，共七十六页。 （5）标准曲线的绘制： (6)测样 第五十页，共七十六页。 四、水杨酸比色法 1、? 原理 样品中的蛋白质经硫酸消化而转化成铵盐溶液后，在一定的酸度和温度条件下可与水杨酸钠和次氯酸钠作用生成蓝色的化合物，可以在波长660nm处比色测定，求出样品含氮量，进而可计算出蛋白质含量。 2、? 主要仪器 分光光度计 恒温水浴锅 第五十一页，共七十六页。 3、? 试剂 ①???? 氮标准溶液 ②