蛋白泛素化检测.pdfVIP

解螺旋 陪伴医生科研成长 泛素化检测实验方法 1. 实验原理 大多数蛋白均需进行翻译后修饰来扩增蛋白质组的数量，调节蛋白质的稳定性、分布和 功能。翻译后修饰包括磷酸化、泛素化、亚硝基化、氧化等等。 泛素化是在蛋白质翻译后,通过将泛素分子结合到靶蛋白上,形成多聚泛素链,带有多聚 泛素链的靶蛋白可被26 S 蛋白酶体识别、降解。泛素是76 个氨基酸的多肽片段，包含7 个 赖氨酸残基，允许同时发生聚泛素化反应。在赖氨酸-48 聚泛素化会导致其通过28S 蛋白酶 体降解。然而赖氨酸-63 可以改变细胞的功能，包括运输和DNA 修复。可见，单一的泛素化 会依据其作用位点的不同而产生不同的结果。 它和泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）和蛋白酶体组成了泛素- 蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System，UPS）。UPS 是细胞内非溶酶体途径蛋白质 降解通路，不仅降解变性、异常或起短暂作用的蛋白质，而且能降解转录因子、内膜蛋白和 细胞周期蛋白等天然蛋白，对于维持蛋白质稳定状态、调节细胞程序性死亡和控制细胞周期 等过程有重要的作用。UPS 还可作用于转录因子及体内的某些信号传导通路，并参与细胞凋 亡、主要组织相容性复合体抗原递呈、细胞周期以及细胞内信号传导等多个细胞生理活动， 对维持细胞正常生理功能具有重要意义。解螺旋/ 2. 实验目的 检测蛋白质的泛素化水平。 1 蛋白A 降低蛋白B 的表达量 1.1 蛋白A 介导蛋白B 降解 1.2 蛋白A 降解蛋白B 的特异性 1.3 蛋白A 介导蛋白B 降解呈剂量依赖性 1.4 蛋白A 调节蛋白B 稳定性 2 蛋白A 介导蛋白B 降解位于蛋白酶体系统 1 解螺旋 陪伴医生科研成长 2.2 蛋白B 降解位于蛋白酶体系统 2.3 蛋白A 介导蛋白B 降解位于蛋白酶体系统 3 赖氨酸XXX 位点为蛋白A 介导蛋白B 泛素化靶位点 3.1 蛋白A 介导蛋白B 泛素化 3.2 赖氨酸XXX 位点为蛋白A 介导蛋白B 泛素化靶位点 4 蛋白A 氨基端与羧基端在蛋白B 降解中的作用 4.1 蛋白A 氨基端与蛋白B 降解 4.2 蛋白A 羧基端与蛋白B 降解 4.3 蛋白A 羧基端与蛋白B 泛素化 解螺旋/ 3. 实验材料 3.1. 主要试剂 （试剂来源仅供参考） 试剂 来源 Cat.No. RIPA 碧云天 P0013C PMSF Bio-Rad MSB1001 Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 4X Leammli 加样缓冲液 Bio-Rad 1610747 β巯基乙醇 Sigma aldrich 60-24-2 Protein Marker 天能 180-6003 脱脂奶粉 生工 A600669 Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 21059 ECL Western Blotting Substrate Thermo Scientific