Western-Blotting实验报告（附答案解析）.pdf

Western Blotting 本次试验的目的是使同学们掌握 Western Blotting 法鉴定目标蛋白的原理和 熟悉 Western Blotting 的方法，并了解抗原抗体结合反应的影响因素。 Western Blotting 的 blotting 译为印迹法，是指将样品转移到固相载体 上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975 年,Southern 建立 了将 DNA 转移到硝酸纤维素膜 （NC 膜)上，并利用 DNA －RNA 杂交检测特定 的 DNA 片段的方法，称为 Southern 印迹法。而后人们用类似的方法，对 RNA 和蛋白质进行印迹分析，对 RNA 的印迹分析称为 Northern 印迹法，对单向电 泳后的蛋白质分子的印迹分析称为 Western 印迹法，对双向电泳后蛋白质分子 的印迹分析称为 Eastern 印迹法。 Western 既可以定性,又可以半定量,是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用 的方法。它通常分为两种方法： Western Blotting 方法一： 直接法 方法二： 间接法 优点: 1.快速（一种抗体) 1 。免特异性不受标记影 2.没有二抗交叉反应引起 响 的非特异性条带 2 。 信号放大灵敏度高 （多个二抗结合位点) 3 。多种标记的二抗可供 选择 4 。 可 选 择 不 同 的 Marker 缺点： 1.免疫反应性降低 1. 交叉反应引起的非特 2.无信号二级放大 异性条带 3 。抗体标记费时昂贵,使 2 。额外的二抗孵育以及 用不方便 条件优化 同时 Wester 又具有多种识别蛋白质的显色方法,主要有以下几种：i 。放 射自显影 ii. 底物化学发光 ECL iii. 底物荧光 ECF iv. 底物 DAB 呈色 现常 用的有底物化学发光 ECL 和底物 DAB 呈色。 一、 实验原理 Western Blotting （蛋白质免疫印迹法）是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋力 的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜 )上，固相载体以非共价 键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相 载体上的蛋白质为抗原,与之对应的第一抗体发生免疫结合反应,一抗再与酶或同 位素标记的第二抗体发生免疫结合反应，经过底物显色活放射自显影以检查电泳 分离的提议目的蛋白成分 .蛋白质印迹技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫 测定特异性高、敏感等诸多优点，能从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量 检测。 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr ）、N,N—甲叉双丙烯酰胺(Bis)和 催化剂(AP) 、加速剂(TEMED 聚合成的三维网孔结构（凝胶）。据有无浓缩效应 可将电泳分为两类: i. 连续系统：缓冲液pH值、凝胶浓度相同，带电粒子靠电荷及分子筛效 应区分. ii. 不连续系统：缓冲离子成分、 pH值、凝胶浓度不同，带电粒子在电