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miR4975p通过靶向WWP1对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和凋亡的调控 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：miR4975p通过靶向WWP1对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和凋亡的调控 1 1、材料与方法 2 2、结果 5 3、讨论 7 文2：瘢痕疙瘩成纤维细胞基因学研究 10 1 基因学研究 10 2 目前基因学研究所面临的问题和展望 12 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 14 文章致谢（模板） 14 正文 miR4975p通过靶向WWP1对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和凋亡的调控 文1：miR4975p通过靶向WWP1对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和凋亡的调控 瘢痕疙瘩是一种良性的真皮纤维增生性肿瘤，是皮肤科和外科手术中最常见、最棘手的问题之一。瘢痕疙瘩在正常的皮肤上扩张超过原始伤口的边缘，常伴有疼痛、瘙痒、畸形甚至严重的功能损害，严重影响患者的生活质量。由于对瘢痕疙瘩的发病机制认识不足，瘢痕疙瘩的治疗仍有许多问题需要解决，并且瘢痕疙瘩的复发率高，术后畸形多，单纯手术切除难以治愈，因此需要开发新的治疗策略。微小RNA(microRNA，miRNA/miR）是一种短链的非编码RNA，大约包含22个核苷酸，能够通过与靶mRNA的互补作用在转录后调节基因表达。miRNA被认为在许多皮肤疾病中失调，包括瘢痕疙瘩。研究表明，miR-497-5p在胃癌组织中下调表达，抑制其表达促进胃癌细胞的增殖和生长，过表达miR-497-5p抑制胃癌细胞的增殖和生长。miR-497-5p在结直肠癌组织和细胞中低表达，上调其表达抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。与正常皮肤相比，瘢痕疙瘩组织中含有WW结构域的E3泛素蛋白连接酶1(WW domain containing E3ubiquitin protein ligase 1，WWP1)mRNA水平显著升高，可能参与成纤维细胞过度增生及细胞外基质沉积而导致瘢痕疙瘩的发生发展。但miR-497-5p在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达及其对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响，且miR-497-5p对WWP1是否存在靶向调控关系目前还尚未可知。因此，本研究以人瘢痕疙瘩成纤维细胞（Keloid Fibroblast，KFB）为对象，考察miR-497-5p的表达，并评价miR-497-5p是否通过靶向调控WWP1影响KFB的细胞增殖和凋亡，旨在揭示其可能的分子机制。 1、材料与方法 主要试剂 DMEM培养基（Dulbecco，sModified Eagle Medium）购自购自Gibco公司，胎牛血清、TRIzol、Lipofectamine 2000、实时荧光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）检测试剂盒购自Invitrogen公司，WWP1、细胞周期蛋白D1(CyclinD1）、p21、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B celllymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2associated X protein，Bax）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）蛋白抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶标记二抗购自北京中杉金桥生物公司，miR-497-5p、anti-miR-497-5p、si-WWP1、pcDNA-WWP1、荧光素酶报告载体购自上海GenePhama公司，噻唑蓝（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）购自美国Sigma公司，AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物公司。 细胞分离培养 收集延安大学附属医院患者术后瘢痕疙瘩和正常皮肤标本，参照杨力等[9]的方法，进行KFB和正常皮肤成纤维细胞（Normal Skin Fibroblast，NFB）的分离培养，即新鲜标本经%洗必泰浸泡、生理盐水洗涤后剪碎成 mm3大小的样本，在含20%胎牛血清的DMEM培养基中培养，细胞生长至70%汇合时进行传代。 qPCR检测miR-497-5p、WWP1mRNA表达 使用TRIzol试剂提取KFB和NFB总RNA，逆转录后，以制成的cDNA为模板，依据qPCR试剂盒说明书的指示，以2-ΔΔCt法测定miR-497-5p、WWP1mRNA表达。引物序列：miR-497-5p正向5’-CCTTCAGCAGCACACTGTGG-3’，反向5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’；内参U6正向5’-