炭疽实验室检测技术杨发莲.pptVIP

造成重大的经济损失，严重影响人、畜健康和生产力发展。随着我国市场经济的发展，人民生活需求的提高，饲养畜密度的增加，动物性食品和毛、皮革制品的利用日趋普及，以及土地资源的开发和环境的改造，各类物资的频繁交流，炭疽对我国人民生命安全和财产构成很大威胁，如不采取及时、有效的监控措施，炭疽发病势将有增无减，隐患无穷。鉴于此种传染性疾病在我国仍属一种高、危病种，加以它尚有自外输入我国的潜在可能，在今后加速发展市场经济的的新形势下，加强各级领导对炭疽防制工作的重视和支持，提高广大的基层相关工作人员对炭疽的认识和防病能力，是很有必要的。要做到早发现、早治疗、早控制，必须有相关丰富的流行病学和临床知识外，一定要熟练掌握相关的实验室检测技术。 第一页，共三十六页。 二、炭疽病原检验程序图1示。 皮肤渗出物、血液、粪便或呕吐物、土壤或动物标本 直接涂片 （革兰氏染色） 细菌培养 必要时做PCR 见到革兰氏阳性大杆菌，可定为临床诊断病例 未见到革兰氏阳性大杆菌，继续别的试验 直接划平板 直接划平板后的标本可增菌培养 培养12~24h，选可疑菌落做青霉素敏感和噬菌体裂解试验 两项均为阳性，可确诊为炭疽 第二页，共三十六页。 三、血清中炭疽抗体水平检测 （一）意义 人血清中炭疽抗体水平检测的意义主要在于下列几个方面：正常人群血清炭疽抗体水平资料收集，特殊人群（产业工人、畜牧人员、实验室人员）血清炭疽抗体水平观察，疫苗接种人群血清炭疽抗体水平分析，患病人群血清炭疽抗体水平研究，在患者标本中未获得炭疽芽胞杆菌阳性检测和分离结果的情况下，血清抗炭疽特异性抗体滴度出现4倍或4倍以上升高也可以结合流行病学线索和临床表现进行确诊。 第三页，共三十六页。 （二）检测方法 目前均为酶联免疫吸附实验（ELISA） 1.标本的采集和保存：发病初期和恢复期（发病后15天左右）各采一次血，血清采集时应尽量避免溶血，因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰读取方法的结果，可造成假阳性，长菌的标本同样的道理易产生假阳性；抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂；标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合，使试剂本底加深，一般血清置4℃冰箱5天内完成测试，如需保存一周以上则要-20℃冰冻保存，融解时应上下颠倒充分混匀，同时避免气泡。 第四页，共三十六页。 2.注意事项：ELISA实验的结果受操作影响很大，每个步骤包括加样、温育、洗涤、显色、酶标仪读数均应认真负责才能充分发挥ELISA的高灵敏、强特异的优点。因此，应建立实验项目的标准操作程序(SOP)。报告方式以定量分析结果的滴度单位表示；检测时应以接种疫苗前或初报告病例地方的人或动物的血清作为阴性血清，如有可能也可设阳性血清对照。阴性血清每次都要和待测标本同时做。 第五页，共三十六页。 （三）具体程序 1.包被抗原：用包被缓冲液将已知抗原稀释至0.3 μg／ml，每孔加0.1 ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。 洗涤缓冲液配方为：Tris 2.42克，1mol/L HCI 13mL,吐温-20（0.05%）0.5mL, 加蒸馏水至1000mL。 2.待检血清反应：加1:8稀释(稀释液为生理盐水)的待检样品0.1 ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育60分钟，洗涤3次，每次3分钟。(同时做空白、阴性及阳性孔对照) 第六页，共三十六页。 3.酶标抗体反应：于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)或SPA 0.1 ml，37℃孵育60分钟，洗涤3次，每次3分钟。 4.显色反应：于各反应孔中加入等体积混合的显色底物A、 B溶液0.1 ml，37℃ 20分钟。 底物A液（磷酸盐枸橼酸缓冲液，pH5.0）配方为：0.2mol/L Na2HPO4(28.4g/L) 25.7mL, 0.1mol/L枸橼酸(19.2g/L)24.3mL, H2O2 0.1% , 蒸馏水50mL。 底物B液[TMB(四甲基联苯胺)使用液]配方为：TMB 3.90g, 枸橼酸10.52g, EDTA 1.86g, 甘油2000mL,DMSO300mL,加热溶解后加蒸馏水至10000mL。 第七页，共三十六页。 5.终止显色：于各反应孔中加入显色终止液(0.5 mol/L H2SO4)0.1mL 终止反应。 6.结果判定：实验结果用酶标仪判读，被检孔OD值达阴性血清对照孔OD值的2.1倍时，始可判为阳性。 四、实验项目 （一）标本采集 （二）细菌培养