6 修改支原体常规检验.docVIP

支原体常规检验 一、实验材料 1.样品 病毒液、细胞液、及活疫苗、血清。 2. 培养基 2.1 检测由禽胚组织或其细胞 细胞成的活疫苗 用改良Frey氏培养基（本单位使用北京海淀中海动物保健科技公司）。 2.2 检测其他种类的病毒活疫苗 用支原体培养基（本单位使用北京海淀中海动物保健科技公司）。 2.3 检测血清 用无血清的支原体培养基（本单位使用北京海淀中海动物保健科技公司）。 3.器材 100ml小瓶、小管（1.0*10cm）、一次性无菌平板（ф70cm）、无菌吸管、5%CO2培养箱，普通37℃培养箱、生物安全柜、煮沸锅及恒温水浴锅 4.培养基的准备 4.1培养基的存储条件： 支原体液体培养基及固体培养基辅助液在-20℃保存。支原体固体培养基在4℃ 4.2培养基的分装及到平板 4.2.1支原体液体培养基（80ml/瓶）于室温融化，轻轻摇匀。无菌条件下分装成20ml/瓶，小管1.8ml/支。放于-20℃ 4.2.2支原体固体培养基辅助液室温溶解后至于40℃ 4.2.3支原体固体培养基加热溶解后，当温度降到60℃（用手握准稍烫手但有可以忍受）左右时，在无菌条件下添加辅助液，轻轻的转动瓶子混匀后按照平皿的规格加入适量的培养基，冷却凝固制成固体平板。放于4℃ 二 检测方法 1 样品处理 1.1细胞液应先将其冻融一次后再进行接种检测。 1.2病毒液可直接检测 1.3冻干疫苗 取3瓶冻干疫苗分别加液体培养基复原成混悬液后混合。 1.4血清直接接种。 2. 样品的检测 2.1 接种与观察 每个样品需同时用以下2种方法检测。 2.1.1 液体培养基培养 将样品混合物5ml，接种小瓶液体培养基中，再从小瓶中取培养物0.2ml移植接种于1支小管液体培养基（1.8ml/支）中，将小瓶与小管放37℃培养，分别接种于5日、10日、15日从培养瓶中取0.2ml培养物移植到小管液体培养基内，每日观察培养物有无颜色变黄或变紫红，若无变化，则在最后一次移植小管观察14日后，停止观察。在观察期内，如果发现小瓶或任何一支小管培养物颜色出现明显变化，在原pH值变化达±0.5时，应立即移植于小管液体培养基和固体培养基，观察在液体培养基中是否出现恒定的pH变化，及固体上有无典型的“煎蛋 2.1.2 琼脂固体平板培养 在每次液体培养物移植小管培养的同时，取培养物0.1～0.2ml接种于琼脂平板，置含5%～10%二氧化碳潮湿的环境、37℃下培养。此外，在液体培养基颜色出现变化，在原pH值变化达 2.1.3 每次检查需同时设阴、阳对照，在同条件下培养观察。检测禽类疫苗时用滑液支原体作为对照，检测其他疫苗时用猪鼻支原体作为对照。 2.2 血清样品的检测 取被检血清按10%的比例加到支原体检验用，按以上方法进行移植、培养，观察小管培养基pH变化情况和琼脂平板上有无菌落。 3 结果判定 3.1 接种被检物的任何一个琼脂平板上出现支原体菌落，判被检验品不合格。 3.2 若阳性对照中至少一个平板出现支原体菌落，而阴性对照中无支原体生长，则检验有效。 注：上述小瓶培养基是指100ml小瓶中盛培养基20ml；小管培养基是指试管（1.0×10cm）中盛入1.8ml培养基。小管与小瓶皆须用胶塞或螺旋塑料塞封口。 4.注意事项 1.每批不同批号的培养基均需做灵敏度实验（方法见附注）。 2.所有检验使用后的物品都需严格原地用消毒液浸泡后移出（新洁尔灭或百毒杀），然后高压灭菌处理。 3. 该项检验所有废弃物都需高压消毒处理。 4.制备固体平板时，辅助液应沿瓶壁加入，添加后轻轻摇动，避免培养基中出现气泡。 5.培养基出现浑浊或变色，应停止使用。