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猪高致病性猪繁殖与呼吸综合病毒检测
一、目 的：建立猪高致病性猪繁殖与呼吸综合病毒RT-PCR检测方法，规范操作程序。
二、适用范围：适用于猪高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测操作。
三、责 任 者：质管部经理、QC检验员。
四、内容：
试剂
1.1 PRRSV TR-PCR检测试剂盒
规格：50头份/盒；厂家：北京世纪元亨动物防疫技术有限责任公司；存储条件：严格按照说明书进行存放。
1.2琼脂糖
规格：100g/瓶；厂家：OXOID；货号：LP0028A；存储条件：10
2．器材
2.1 电子天平
型号：JMCCL；厂家：余姚纪铭称重检验设备有限公司
2.2高速台式离心机
型号：TGL-16型；厂家：上海医用仪器分析厂
2.3PCR扩增仪
型号：TC-6C型；厂家：杭州博日科技有限公司
2.4电泳仪
型号：DYY-6型；厂家：北京六一仪器厂
2.5紫外分析仪
型号：WD-9403D 型；厂家：北京六一仪器厂
2.6微波炉
型号：WP800TC23-K3；厂家：佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限责任公司
2.7其他
可调移液器、称量纸、1.5mL灭菌离心管、4℃冰箱、-20℃冰箱、离心管架、500mL量筒、500mL锥形瓶、吸头（10μL、200μL、1000μL）、灭菌去离子水、镊子、一次性手套、口罩、96孔离心管平板
3．样品的制备
3.1 猪血清：用50~200μL的可调移液器取100μL待检样品于1.5mL灭菌离心管中。
3.2 阳性对照：混匀后用50~200μL的可调移液器取100μL于1.5mL灭菌离心管中。
3.3 阴性对照：混匀后用50~200μL的可调移液器取100μL灭菌去离子水于1.5mL灭菌离心管中。
3.4 注意事项：
3.4.1 试剂使用前要充分混匀，每种试剂使用前要核对好试剂标签，避免用错试剂。
3.4.2 样品做好标记和记录。
3.4.3 在吸取样品时，每个样品使用一个枪头，枪头不可触及别的地方，防止污染；加入裂解液时尽量不产生气泡，垂直于1.5mL灭菌离心管上方1cm，沿一侧管壁缓慢加入，每加入完，立即将盖子盖上。
3.4.5 操作过程中必须戴手套、口罩。
3.4.6 移液器的使用要按标准操作规程操作。
3.4.7 待测样品最好不要来回冻融，取完样品后及时进行保存。
3.4.8 所有试剂必须以试剂名称标签为准，且应在规定的温度储存，使用后立即放回。
4 病毒RNA的提取
4.1. 将待测样品、阴性对照和阳性对照，用100~1000μL的移液枪吸取600μL裂解液分别加入，充分颠倒混匀，室温静置3~5 min。
4.2将全部的液体吸到套有收集管的吸附柱中，按照离心机标准操作规程进行操作，13000rpm离心30 s，弃去收集管的液体，套上收集管。
4.3向吸附柱中600μL的洗液，按照离心机标准操作规程进行操作，13000rpm离心30 s，弃去收集管的液体，套上收集管。
4.4重复步骤4.3操作，然后按照离心机标准操作规程进行操作，13000rpm离心2 min。将吸附柱移入新的1.5mL灭菌离心管中，在膜中央加入25μL的洗脱液，室温静置1 min，13000rpm离心30 s，获得总RNA。
4.5注意事项：
4.5.1拿取套有收集管的吸附柱时要托住套管，防止套管脱落，液体洒落。
4.5.2离心结束取出吸附柱时不要晃动，避免套管中液体粘到膜上。
4.5.3向吸附柱加液时一定要注意，不要将管中的捅破。
4.5.4若暂时不进行PCR扩增可于4℃保存，若要第二天进行扩增，需-20
5 RT- PCR操作
5.1 每份总体积20μL，取16.8μL TR-PCR反应液（用前混匀），1.2μL酶混合液，2μL样品RNA。
5.2 由于是微量取液，为了减少误差可计算出TR-PCR反应液和酶混合液的总量混合再分装。由于分液过程中枪头有液体挂壁现象通常要多配出一份的量。如：n份样品，配制（n+1）份，取16.8×（n+1）μL的PTR-PCR反应液于1.5mL灭菌离心管，再加入1.2×（n+1）μL的酶混合液混匀，用2~20μL的移液器、10μL的枪头吸取18μL分装于0.2mL薄壁PCR管中，分装时将液体加入到管底，避免产生气泡，再加入2μL待扩增DNA提取液。用吸头吹吸混匀，作好标记。
5.3 扩增条件为42℃45min，94℃ 3min后，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，循环35次，72℃延伸7
6 电泳
6.1 琼脂糖凝胶的配制
称3g琼脂糖放于500mL锥形瓶中，加入50倍稀释的50倍TAE电泳缓冲液200 mL（取4mL 50倍TAE电泳缓冲液用双蒸水稀释至200mL）摇匀，按微波炉标准操作规程操作调至中火5 min，将其放入微波炉中熔解，再加入10μL染
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