5 猪蓝耳病毒基因鉴定操作规程.docVIP

高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（JXA1-R株）基因鉴定检测 一、目 的：建立高致病性猪繁殖与呼吸综合病毒基因鉴定检测方法，规范操作程序。 二、适用范围：适用于高致病性猪繁殖与呼吸综合征基因检测操作。 三、责 任 者：质管部经理 QC检验员。 四、内容： 试剂 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-R株实时荧光TR-PCR检测试剂盒 规格：50头份/盒；厂家：北京世纪元亨动物防疫技术有限责任公司；存储条件：严格按照说明书进行存放。 2仪器 2.1 荧光PCR仪。 型号：LineGene3320 厂家：杭州博日科技有限公司 2.2高速台式离心机 型号：TGL-16型；厂家：上海医用仪器分析厂 2.3其他 可调移液器，八联管、1.5mL灭菌离心管、4℃冰箱、-20℃冰箱、离心管架、止血钳、500mL量筒、500mL锥形瓶、吸头（10μL、200μL、1000μL）、灭菌去离子水、镊子、一次性手套、口罩、96孔离心管平板 3．样品的制备 3.1 活疫苗：根据疫苗规格用0.85%的生理盐水稀释成1头份/ml，取100μL于1.5mL灭菌离心管中。 3.2 阳性对照：混匀后取100μL于1.5mL灭菌离心管中。 3.3 阴性对照：混匀后取100μL灭菌去离子水于1.5mL灭菌离心管中。 3.4 注意事项： 3.4.1 试剂使用前要充分混匀，每种试剂使用前要核对好试剂标签，避免用错试剂。 3.4.2 样品做好标记和记录（实验编号和原始编号）。 3.4.3 在吸取样品时，每个样品使用一个枪头，枪头不可触及别的地方，防止污染；加入裂解液时尽量不产生气泡，垂直于1.5mL灭菌离心管上方1cm，沿一侧管壁缓慢加入，每加入完，立即将盖子盖上。 3.4.5 操作过程中必须戴手套、口罩。 3.4.6 移液器的使用要按标准操作规程操作。 3.4.7 待测样品最好不要反复冻融，取完样品后及时进行保存。 3.4.8 所有试剂必须以试剂名称标签为准，且应在规定的温度储存，使用后立即放回。 4 病毒RNA的提取 4.1. 将待测样品、阴性对照和阳性对照，用100~1000μL的移液枪吸取600μL裂解液分别加入，充分颠倒混匀，室温静置3~5 min。 4.2将全部的液体吸到套有收集管的吸附柱中，按照离心机标准操作规程进行操作，13000rpm离心30 s，弃去收集管的液体，套上收集管。 4.3向吸附柱中600μL的洗液，按照离心机标准操作规程进行操作，13000rpm离心30 s，弃去收集管的液体，套上收集管。 4.4重复步骤4.3操作，然后按照离心机标准操作规程进行操作，13000rpm离心2 min。将吸附柱移入新的1.5mL灭菌离心管中，在膜中央加入25μL的洗脱液，室温静置1 min，13000rpm离心30 s，获得总RNA,20℃保存 4.5注意事项： 4.5.1拿取套有收集管的吸附柱时要托住套管，防止套管脱落，液体洒落。 4.5.2离心结束取出吸附柱时不要晃动，避免套管中液体粘到膜上。 4.5.3向吸附柱加液时一定要注意，不要将管中的捅破。 5反应体系的配制及扩增 5.1设被检样品、阴性对照、阳性对照总和为N，则反应体系的配制如下： 灭菌的去离子 6.6ul(N+1) 反应液 14.3ul（N+1） 混合酶液 1.0ul（N+1） 荧光探针 1.1ul（N+1） 将以上配制反应液体系充分的混匀后，分装每个反应管中各23ul。 5.2分别去已溶解的病毒RNA2ul,加入相应的反应管中，混匀并做相应的记录。在荧光PCR仪上进行以下反应：42℃45min，95℃ 10s，95℃ 5s，60℃ 5.3注意事项： 5.3.1八联管不能在盖子上做标记，以免影响透光效果。 5.3.2 在扩增的过程中不能将荧光仪的打开盖。 5.3.4 建议每次进行扩增前都要进行增益调节后确定增益值。 6.5 结果判定 结果判定：阳性对照Ct值无≤30并出现特定的扩增曲线，阴性对照应无Ct值，并且无特定扩增曲线，实验结果方成立。 被检样品Ct值≤30并出现特定的扩增曲线时为阳性；被检样品30<Ｃt<37，并出现特定的扩增曲线，需重新再做一次后进行结果判定，如两次结果相同，则可判为阳性；被检样品Ct值≥37时，超过本方法检测的灵敏度范围，判定为阴性。