生化技术第五章凝胶过滤.pptx

1 也叫凝胶过滤（gel filtration）、凝胶排阻层析 第一节 基本原理 凝胶过滤是利用凝胶的立体网状结构根据分子大小进行分离的一种方法。 第五章 凝胶层析 （gel chromatography ） 2 3 蛋白质在凝胶中的速度决定于内水、外水的分配系数（Kav） Vo：外水体积（凝胶颗粒间体积） Vi：内水体积（凝胶颗粒内部空间体积） Vt--Vo Ve--Vo Kav = 4 大分子：不进入颗粒，完全被排阻，Kav=0，速度最快 小分子：完全进入颗粒，凝胶内外浓度一致，Kav=1，速度最慢 中等大小分子：只有部分凝胶内部空间能达到，内部浓度小于外部浓度。即1＞Kav ＞0 5 第二节 常见的凝胶层析介质 一.葡聚糖凝胶（商品名： Sephadex） 1.结构：以葡聚糖为骨架，以3-氯-1，2-环氧丙烷为交联剂， 结构： 6 2. 性能特点： （1）外观颜色：白色珠状凝胶。 （2）溶胀性：交联度不同，膨胀度、吸水量、分级范围、颗粒大小有很大不同。型号：G—10、G—15、G—25、G—50、G—75、G—100、G—150、G—200 G表示凝胶，数字为得水值，即 吸水量/克干胶×10。得水值越大，凝胶的孔径越大。 （3）物理稳定性： 稳定，可耐高温、高压灭菌处理。 7 （4）化学稳定性：稳定，在水、盐、碱、弱酸、强酸稀溶液、有机溶剂中稳定。但在强酸或氧化剂存在时可使糖苷键断裂。易受微生物污染，室温长期保存需加防腐剂。 （5）机械强度：交联度越高，机械强度越高。 G—10、G—15是刚性的， G—25、G—50也可。其他的则差。 （6）吸附性：新购的对蛋白质具有不可逆吸附作用。 8 3.用途 ①脱盐：通常使用的是G—10~G—50，因为它们的孔径小，蛋白质不能进入凝胶内，只有盐离子可以进入。所以可以将蛋白质与盐分开。 ②分离提纯蛋白质（G—75，G—200） 9 二 .琼脂糖凝胶 瑞典：Sepharose， 美国：Bio-gelA ，英国：Segevac 从天然琼脂中得来的天然物。 单体： D-半乳糖和3，6脱水的L-半乳糖联结而成。 结构： Sepharose为束状琼脂糖以氢键交联成的立体网状颗粒。按其浓度分为Sepharose2B（2%）、 Sepharose4B（4%）、 Sepharose6B（6%） 交联琼脂糖（ Sepharose CL)，为琼脂糖与1，3-二溴异丙醇交联成的， Sepharose CL-2B、 Sepharose CL-4B、 Sepharose CL-6B孔结构不变，对热的稳定性有所提高。 10 2. 性质 （1）稳定性：热不稳定（60℃即开始熔化）。 （2）机械强度：同类产品不同型号性质有差异。如Sepharose4B比2B机械强度大，但网孔小。 Sepharose CL比同型的Sepharose机械强度高。 3. 用途：多用于分离纯化分子量达几百万的分子和颗粒，如病毒、核酸和多聚糖。 11 第三节 操作 处理→装柱→加样 →洗脱→再生 一.凝胶的选择与处理 1. 型号选择：使分离物的分子量包含在其分离范围内。 2. 颗粒大小的选择：一般用中粒100-200目。 颗粒小，分离效果好，但流速慢； 颗粒大，流速大，但分离效果差。 3. 凝胶用量的计算： g=Vt/膨胀度 4. 凝胶处理： 溶胀——充分溶胀才可使用。 抽气——将凝胶网孔中的气泡排除。 12 二 .装柱 三.加样 样量少，体积小，分离效果好。 四.洗脱 一般为单一的缓冲液或盐溶液、有时可用蒸馏水作洗脱液。 五、再生和保存 葡聚糖凝胶易被微生物污染而水解，若放置几天，需加防腐剂。 长期不用：反复洗涤去除杂质。50%乙醇浸泡脱水，依次提高乙醇浓度直至95%。抽干，60-80℃烘干。 13 第四节 应用 一、脱盐和浓缩：小网孔的干凝胶可以吸水，使用它会使高分子溶液得到浓缩。 二、分离生物大分子：根据分子量大小不同进行分离。适用于理化性质相似（溶解度、带电性质等） 三、去热源物质 热源物质 是一种糖蛋白。在制备水解蛋白、核苷酸、酶等注射剂时，常用凝胶过滤去热源物质。 14 四、测定分子量： 蛋白质分子量的对数（lg M）与 Kav呈线性关系，可以利用已知分子量的标准蛋白在同样条件下做凝胶过滤，划出标准曲线。由曲线则可得到未知蛋白的分子量。 lg M Kav 细胞色素c 牛血清蛋白  球蛋白