PCR引物设计(以p53基因为例).ppt

p53基因引物设计 临床八年1305班 第一页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。 CONTENTS 目录 Part 1 引物设计原则 Part 2 获取目的基因 Part 3 引物设计 第二页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。 引物的设计原则 设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率 PART ONE 第三页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。 1 2 引物长度 一般引物长度为18~30碱基。决定引物熔解温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。长度越长，Tm值越大。 长度过长，退火温度和延长温度相差太小，不利于延伸反应。长度过短，特异性低 GC含量 一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴 引 物 设 计 原 则 第四页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。 3 引物自身和引物之间 引物自身不应形成二级结构（如发夹结构） 引 物 设 计 原 则 引物之间不能形成二聚体（包括同种引物之间或上游引物与下游引物之间）且引物不能与DNA其他区域错配 第五页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。 引 物 设 计 原 则 4 引物末端 引物3′端：由于延伸从3′端开始，因而不能进行任何修饰；同时不应选择A，因为A-A、A-G错配。 3’端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发 引物5′端：主要限定引物长度，对扩增特异性影响不大；可以修饰，如添加限制性内切酶位点，将PCR产物亚克隆 第六页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。 引 物 设 计 原 则 引物5′端修饰技术 附加核酸序列 用 途 限制酶位点 克隆（如定向克隆） 噬菌体启动子 合成RNA探针、测序 蛋白质结合序列 产物纯化、检测 核糖体结合序列 高效表达 加错配碱基造成突变 定点诱变 5 避开靶基因的二级结构区 第七页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。 PART TWO 获取目的基因 利用Genbank数据库搜寻DNA、mRNA或者蛋白质序列来设计引物 第八页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。 获 取 目 的 基 因 /genbank/ 第九页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。 第十页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。 mRNA对应DNA序列 蛋白质一级结构 蛋白质编码区 第十一页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。 外显子对应的DNA序列、基因、编号 第十二页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。 单击CDS后 第十三页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。 PART THREE 引物设计 利用生物软件和网页进行引物的设计和评价 第十四页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。 引 物 设 计 Primer premier 5 最常用的引物设计软件 Oligo 7 常和PP5联用评估引物 NCBI Primer-blast 近几年NCBI推出的网站 第十五页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。 第十六页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。 此区域输入待测DNA序列 第十七页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。 第十八页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。 第十九页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。 第二十页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。 第二十一页，编辑于星期二：二十一点 二十四分。