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石蜡切片技术 植物组织石蜡切片技术 石蜡切片法是显微技术上最重要、最常用的一种方法。它是把材料封埋在石蜡里面，用旋转切片机切出很薄（6～8微米）的切片用于显微观察。 石蜡切片的一般步骤： 1．固定 2．洗涤 3．脱水 4．透明 2．封埋 6．切片 7．粘片 8．脱蜡 9．染色 10．脱水 11. 透明 12．封片 1.固定 固定的意义：固定就是用药品把细胞杀死，使细胞的原生质凝固，死后不发生变化，尽可能保持原来的结构以供我们观察。良好的固定剂，应是穿透力强，使细胞立刻致死，原生质全部凝固；不发生任何变形，增强折光率，并且不妨碍染色。 固定液的分类及常用固定液： （1）简单固定液：酒精、甲醛、醋酸 （2）混合固定液： FAA固定液、卡诺氏液、纳瓦兴 (Navaschjn‘s)固定液 。 2.洗涤 材料固定后，药剂继续留在组织中，易使组织破坏，必须用水或酒精洗去。 用什么去洗，可根据三条原则：1．凡用水溶液配制的固定液，特别是含有铬酸、重铬酸钾的固定液，一律用水洗。2．凡用酒精配制的固定液，一律用同浓度的酒清洗。3．如固定液中含有苦味酸．在70％酒清中停留稍久时，可除去黄色。如用升汞固定的材料，在洗涤时，须加碘液，可除去汞的结晶。 3.脱水 材料洗涤后，其中含水，水与石蜡不能混合，必须除去。去水用酒精，材料由水入酒精中，不能操之过急，须由低度酒精渐至高度酒精。通常由30％、50％、70％、80％、90％、100％，每次须经半小时或更长时间，材料大的，时间须延长。若暂时不能埋蜡、材料可放在70％酒精中保存，经久不坏。在高度酒精中，不能过久．因酒精能使材料硬化，过久则材料由硬而脆，切时易于粉碎。 4.透明 材料脱水后，材料中全含酒精，酒精与蜡也不能混合，仍须除去。脱酒精通常用二甲苯（或氯仿），材料由酒精入二甲苯，最好也渐次进行，先经纯酒精二甲苯混合液，再入纯二甲苯中，纯二甲苯须换一、二次才行。时间每次约1小时。二甲苯不仅脱去酒精，并且透明，所以又叫透明剂。 5.埋蜡 埋蜡是把材料封埋在石蜡里面，便于切片。一方面材料太小太软封在石蜡中，石蜡硬度适中，靠石蜡支持，才能切成薄片。另一方面，材料封埋后，不仅材料外面包着蜡，材料内面所有空隙也都充满着蜡。这样，材料的各部分都能保持原来的结构与位置，切片不致发生破裂或其他变形。 材料透明后，要进行浸蜡，才能进行埋蜡。浸蜡也宜于渐次进行，一般先用石蜡和二甲苯的混合液（50%级和70%级）浸蜡，再用纯石蜡换三次，每次的时间，视材料大小而定，通常每次半小时，材料大，时间必须加长。在浸蜡的过程中，须注意温度，不能超过石蜡熔点2℃以上 。 6.切片 切片前的准备工作：石蜡块的分割、整修和固着 。 工具： 单面刀片、酒精灯、烫蜡铲、木块、垫桌纸、火柴、切片机、小木板。 7.粘片 将切好的切片置于载玻片上的过程。粘片时必须注意蜡带伸展完全，故粘片与展片都是在载玻片上完成的。 粘片时的用具 ： 1.电热展片台, 2.载玻片(洁净的) 3.解剖刀 4.眼科镊子, 5.蒸馏水(或4％福尔马林液)，装入l00ml滴瓶中, 6.粘贴剂(蛋清甘油), 7.木质摊片架，8.有光泽的白纸，9.记号笔，10.纱布，11.培养皿等。 8.染色 染色的目的:组织着色才便于在显微镜下观察，用不同的染料复合染色是为了区分不同的组织和细胞结构。 常用染料 ：爱氏(Ehrlich‘s)苏木精染色液、海氏 (Hedenhain’s)苏木精染色液、番红(safranin) 、固绿(fast green) 、碱性品红(basic fuchsin)、石炭酸一品红染色液等。 一般切片的染色程序（番红－固绿染为例）： 9.封片 1）封藏的目的 ：将完成制片全过程的材料用封藏剂封固以便长期保存。选用适合在显微镜下观察的较高折射率(加拿大树胶为n=1.524)封藏剂，获得透明和显示组织详细结构的制片，供分析，照相研究用。 2）封藏剂种类 ：常用的封藏剂有加拿大树胶(canada balsam)。甘油胶(glycerin balsam )等。 水稻幼穗组织爱氏苏木精整染法 （1） FAA固定液固定幼穗组织24小时以上。 （2） 50％酒精洗涤2~3次，每次1小时。 （3）爱氏苏木精稀释液中整染2天 。 （4）水洗，返蓝，换水2～3次，水洗1天。 （5） 脱水及复染 ：经20％，40％，60％，75%（过夜），85%各级酒精，每级约2小时，0.5％伊红酒精（95％）染液4～6小时，无水酒精脱水2次，每次1.5小时。 （6）透明：纯酒精/二甲苯＝1∕1浸渍2小时，再转入纯的二甲苯中二次，每次1小时，至大体呈明亮感即可。 （7）浸蜡：将组织留在透明剂中，轻轻倒上等体积已熔化的石蜡，放入40℃