质粒中提中文版(Omega).docVIP

质粒中提中文版(Omega) 质粒中提中文版(Omega) PAGE 质粒中提中文版(Omega) 中提质粒步骤 材料准备： 灭菌250或500mL三角瓶，托盘天平，5mL移液枪及枪头，卫生纸，废液缸，记号笔，50mL圆底离心管，15mL尖底离心管 步骤： 集菌 将100mL菌液分批倒入50mL圆底离心管中，室温12000rpm离心1min，弃流出液体，打开盖倒置吸水纸上控干。 加入 solution I（提前加入RNase，4℃保存），重悬细菌沉淀（可使用5mL移液枪吹打）。 加入 solution II，轻柔混匀（颠倒离心管7-10次），以获得清亮的裂解物，室温静置3-5min。（此步主要是碱裂解细菌，使其中的蛋白质和DNA变性，反应时间不能太长，否则容易使大肠杆菌的基因组DNA断裂成小片段，污染质粒DNA） 加入 Buffer N3，轻柔混匀（颠倒离心管7-10次），直至形成白色沉淀，室温静置2-3min。 4℃ 12000rpm离心10min，使白色沉淀沉于底部。 取出一个Lysate Clearance Filter Syringe，抽出活塞，小心将5中液体全部转移至注射器中（注射器可不放活塞直接直立于4中的离心管中，液体不会出来），室温静置2min。 将6中注射器放置于一新的15mL离心管，轻推注射器活塞，使液体流入离心管中。 加入倍体积的ETR（约600uL）至过滤后的液体中，混匀（颠倒离心管7-10次），冰浴20min，期间颠倒离心管几次。 （此期间准备一个Hind-Bind DNA midi Column加入2mL GPS Buffer，室温静置10min，4000rpm离心5min） 42℃温浴5min，溶菌液变浑浊，室温4000rpm离心5min，则ETR沉入底部。 小心将上层液体转移至一新的15或10mL离心管中，加入倍体积的EtOH（约），轻柔混颠倒5-6次，室温静置2min。 将10中液体加入柱子中，室温4000rpm离心5min，弃液体，重新装好柱子，直至液体全部滤过。 加入3mL Buffer HB，室温4000rpm离心5min，弃液体。 加入 DNA Wash Buffer，室温4000rpm离心5min，弃液体。 重复13 空甩洗脱柱，室温4000rpm离心15min。 将结合柱置于一新的15mL离心管中，60℃温箱干燥10-15min。 加入250uL Elution Buffer，室温静置2-3min，室温4000rpm离心10min。 将洗脱下来的液体置于新的离心管中，做好标记，测浓度并保存。