新型冠状病毒核酸标本的检测及注意事项.pptx

新型冠状病毒核酸标本的检测及注意事项;;新冠核酸检测实验室分区设置及功能;医疗机构新冠病毒核酸检测工作手册（试行第二版）（2020年12月28日）;操作区域：试剂准备区。该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备； 试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区，不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂； 试剂的质检； 耗材的质检（生产、破损）。;6;7;标本前期处理（小样本量） 1.标本接收-安全柜内开箱，清点，签字-热灭活(含胍盐管无需热灭活) 2.安全柜内拆密封袋-编号-录入信息;从3合1到10合1混采检测技术;/xinwen/2020-08/19/content_5535756.htm;11;12;“混检”：几个缺点： 没有减少采样管的使用，反而增加实验室的工作量； 容易因为混合样本出现差错； 降低检测分析敏感性，会造成较弱阳性标本不能检出;新冠标本核酸提取;新冠标本核酸提取;新冠标本核酸提取;检测系统的配套问题：核酸提取试剂、核酸提取仪、荧光RT-PCR扩增检测试剂盒、荧光PCR扩增仪（四个不同部门，不同层级的批准证书） 如达安核酸检测试剂盒说明书：配套提取试剂—本公司生产的xxx号，xxx号；配套扩增仪—ABI7500，LightCycler480。;以采用之江试剂，自动提取仪提取为例;深孔板A行朝左置于核酸自动提取仪，插入磁套，选择RNA Isolation 2，点击Start;新冠标本核酸扩增;21;22;23;24;25;26;试剂厂家;质量控制：应覆盖人，机，料，法，环等各个环节 室内质控：设置1个第三方的弱阳性质控(检测限1.5-3倍)参与从提取到扩增的全过程。注意：如购买高浓度质控品稀释成弱阳性质控，应特别注意防止质控品造成的实验室污染。 快检室内质控：每次开机前，先检测弱阳性质控品和阴性质控品，质控合格后，开始进行临床标本检测，每隔24小时或连续检测50个样本后，均需再次检测弱阳性质控品，监测是否在控。 室间质量评价(EQA);①SARS-CoV-2核酸检测为何要做性能验证？;准确度(Accuracy)验证 准确度：即为检测结果和真实结果的一致程度，是所有检测试剂必须验证的性能指标之一。可参照试剂说明书上描述的性能确认方案进行设计。但绝大部分国产新冠核酸检测试剂说明书上只有性能确认后的结果而无性能确认过程，此时可参照国外FDA EUA授权试剂说明书进行检测性能验证方案设计。; 取SARS-CoV-2阴性及阳性样本各20例进行待验证方法与参比方法的平行检测。其中，阴性样本可为既往的其他呼吸道感染或其他疾病患者的临床样本；阳性样本最优为COVID-19确诊患者的临床样本，也可使用添加有灭活新型冠状病毒的临床样本、添加有灭活新型冠状病毒RNA的临床样本或人工模拟样本。根据检测结果绘制2×2表，计算阳性符合率(Positive Percent Agreement, PPA）和阴性符合率(Negative Percent Agreement, NPA）。若PPA和NPA均≥95%，则为达到厂家宣称的准确度水平。;精密度（ Precision）评价 实验室可利用新冠病毒核酸检测定值标准品或精准定值的模拟样本进行试剂最低检测限及精密度验证。实验室可将定值标准物质按2-3倍梯度稀释至厂家声明的检出限浓度(如500 copies/mL)以下，每个浓度梯度重复测定10次。若阴性样本(即稀释浓度低于C5或为零浓度样本)阴性检出率为100%(10/10)；弱阳性样本（即稀释浓度略高于LOD的样本）阳性检出率为100%(10/10)；中/强阳性样本阳性检出率为100%(10/10)，同时阳性样本的重复检测Ct值CV＜5%，则检测精密度验证通过[1-2]。;检测限(limit of detection, LOD) 评价 美国CLIA并不强制要求实验室开展检测试剂LOD的验证。但在我国，根据CNAS发布的《分子诊断检验程序性能验证指南》建议，在所用检验程序在厂商试剂使用说明书有检测限声明时、有标准物质时或以定量形式表达定性结果时，应进行检出限的验证[1]。 实验室可通过利用新冠病毒核酸检测定值标准品或精准定值的病毒模拟样本进行，如可将定值标准物质按2-3倍梯度稀释至厂家声明的检出限浓度（500 copies/mL）以下，随后每个浓度梯度使用检测试剂重复测定10次。如果≥95%LOD浓度以上的样本检测呈阳性，则该试剂的LOD验证通过。;生物安全、防核酸污染;以之江试剂为例，检测下限为200cp/mL=200cp/1000μL，相当于60cp/300μL，也就是说每个提取板加样孔落进60个拷贝就可检测出阳性。