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..
慢病毒生产及使用操作手册
一、实验流程
制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体分别进行高纯度无毒素
抽提,共转染 293T 细胞,转染后 6 h 更换为完全培养基,培养 48 和 72h 后,分别收集富
含慢病毒颗粒的细胞上清液,病毒上清液通过超离心浓缩病毒。以下容由汉恒生物科技 (上
海)有限公司精心整理总结。
二、实验材料
(一)慢病毒载体、包装细胞和菌株
TM
该病毒包装系统为三质粒系统,组成为 pspax2, pMD2G, pHBLV 系列质粒。
1、载体信息(见附录)
2 、细胞株 293T ,慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞,生长培养基为
DMEM(含 10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株 大肠杆菌菌株 DH5 α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、包装细胞 293T 细胞的培养
(一)293T 细胞的冻存
随着传代的次数增加,293T 细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的
出现,我们需要在开始就对细胞进行大量冻存,以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数
生长期进行冻存,增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液,加入 PBS 洗去残留的培养基;
2、加入 0.25%的胰酶,消化 1 2min 后,镜下观察细胞变圆,细胞间间隙加大时,去除
~
胰酶,加入新鲜培养基吹打混匀,移入离心管中。
3、细胞计数,将细胞全部晃下,加入 3mL 37 ℃ 预热的 10% DMEM,用 10mL 移
液管进行吹打,较大力吹打 6 ~8 次即可,不留死角,之后,将所有细胞吸出,置于15mL
离心管中,取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中,加 入 450ul 10% DMEM,
即为 10 倍稀释,混匀,取 10ul 细胞于计数板 中计数。计数板上共 4 大格,每大格 16 小
格。计数时,4 大格均计 数,总数除以 4 (得每大格细胞数),再乘以 10 (10 倍稀释),
即 为实际 n 万/mL 细胞浓度。
Word资料.
..
4 、细胞离心,1000rpm,5min。去掉上清。
5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液(70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO),重悬细
6
胞,密度为 3 x 10 个/ml 。
6、分装进细胞冻存管,放入冻存盒中,放入-80℃超低温冰箱。
7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存,并作记录。保存过程中,要不时复苏细胞检
测细胞存活率,观察细胞状态等。
(二)293T 细胞的传代
当细胞生长到汇合率达到 80% ~90%时需要对细胞进行传代操作,以扩大细胞数量,维
持细胞良好的生长状态。
1、消化细胞,方法同细胞冻存。
2、细胞离心结束后,加入完全培养基重悬。
3、根据具体情况,将细胞分到 10cm 培养皿中,每个培养皿补足到 10ml 培养基。
4 、将培养皿平稳放回 37℃、5%CO2 和 95%相对湿度的培养箱中培养。
(三)293T 细胞的复苏
当细胞传代次数过多,细胞状态变差时,或者细胞出现污染事故时,需要丢弃并对最初
冻存的细胞进行复苏。
1、设置温度为 37 ~42℃的水浴。
2、查看细胞库记录,根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞(需戴上棉手套,防止被冻
伤),迅速丢入水浴锅中并快速晃动,尽量在 1 ~2min 使细胞溶液完全溶解。
3、将细胞溶液转移到 15ml 离心管中,并在其中加上 1ml 新鲜的完全培养基,混匀后
离心,1000rpm,5min。
4 、去掉上清,加入 5ml 新鲜的完全培养基
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