第七章--蛋白质(或多肽)的放射性标记及分析方法.ppt

2021/9/12 * （2）TDPAC的应用举例 由（1）中关于TDPAC的基本理论可知,TDPAC是将级联γ放射性的核素（如99Mo）,用化学标记法或生物合成标记法,引入生物大分子中（如MoFe蛋白或Mo贮存蛋白）中,以这一放射性核素为微观探测原子核,通过观察和测定在不同理化条件下,扰动角关联的电四级相互频率Ve、不对称系数η及驰豫时间常数λ等参数的变化,来推测探测原子核（如99Mo）周围的电荷分布和电荷转移等微环境的变化。 1992年Schwab等用DAPC方法研究了转铁蛋白等生物大分子的结构。 1993年,Morttner等用TDPAC法对99Mo培养的克氏肺炎杆菌固氮细胞及在氨气存在下如99Mo培养的棕色固氮菌细胞进行了研究。分别测定了上述细胞中MoFe蛋白和Mo贮存蛋白中99Mo周围的核四级相互作用信息。利用TDPAC法测定MoFe蛋白和Mo原子周围化学环境在不同外界条件下的变化,从而可为Mo在Fe Moco中的状态和作用提供直接证据。 1993-1996年,黄巨富等利用TDPAC技术证明了MoFe蛋白制备成缺失金属原子簇的不全蛋白后,能与“重组溶液”重组组装出具有固氮活性的FeMoco结构。 2021/9/12 * 4、利用放射性银饱和法测定金属硫蛋白 （1）银饱和法的测定方法 取MT样品200ul于反应管中,加110MAgNO3溶液（10 ppm,10000 cpm和0.5 M甘氨酸缓冲液（pH 8.5）1.5 ml,20℃温育5 min,取上清液再加200 ml羊溶血产物加热,重复该步骤三次。取上清液于测定器中,用FJ-603#型γ闪烁仪测定样品的放射性活度。 （2）实验结果的计算 金属硫蛋白与Ag+结合到达饱和时,每分子金属硫蛋白上结合17个银离子,根据这一关系可导出样品MT含量的计算式: MS=（mM1/KM2）×（CS-CN）/(CT-CN) × 样品稀释倍数 其中MS=待测样品MT含量;m=每反应管中加入的银离子重量;K=银离子与MT的摩尔比=17;M1=MT的平均分子量=6500;M2=银的原子量=108;CS=待测样品cpm;CN=空白管cpm;CT=每反应管cpm。将M1、M2与K值代入上式得; MS=3.54m ×（CS-CN）/(CT-CN) × 样品稀释倍数 2021/9/12 * ④ 固相碘化法 IODOGEN是近年来发展起来的一种固相125I化标记试剂。 名称1,3,4,6-四氯-32,62-二苯基甘（代）联脲（1,3,4,6-Tetrachloro-32,62-diphenlglycouril）。 1978年Fraker和Speck首次介绍用IODOGEN对蛋白质和细胞膜进行125I标记。 IODOGEN不溶于水,故可以固相形式参与蛋白质的碘化过程。以后相继报导用IODOGEN碘化标记大肠杆菌核糖体蛋白质、家兔网织细胞核糖体蛋白质、仙台病毒、人生长激素和促甲状腺素、人细胞和组织培养的细胞、大鼠纤维蛋白质和人纤维蛋白质等。 下面介绍利用IODOGEN 125I标记方法标记经去污剂Sarkosyl NL-97裂解的甲型流感病毒的基本过程。 A、IODOGEN固相的制备 IODOGEN 1 mg溶于1 ml氯仿中,取10 μl加入12×75 mm玻璃试管中,室温下在通风橱内用氮气气流将溶剂挥发,待彻底干燥后即可用于标记。 B、流感病毒的裂解 纯化的甲型流感病毒X-31（H3N2）50 μg,悬浮于100 ml STE（PH 8.0）中,加入25 μl 10 % Sarkosyl NL-97,37℃温育15 min。 2021/9/12 * C、碘化反应 用STE（0.15M氯化钠、10 mM Tris、1 mM EDTA、PH 8.0）充分洗涤。已制备好的IODOGEN固相反应器,以除去管壁上附着不牢固的IODOGEN。将已裂解的病毒悬浮液加入管内,随即加入125I-NaI 0.5 mCi（110 mCi/ml）,室温下反应30 min,间或轻轻震荡试管,以增加病毒和125I-NaI与固相IODOGEN的接触机会。吸出管内全部液体,则反应自行终止。以葡聚糖凝胶G-50柱层析除去未标记游离碘。标记病毒的放射性可达3～10 mCi/mg蛋白。 D、对IODOGEN碘化法的评价 此法非常简便有效。碘化反应可在0～37℃下进行,反应不受去污剂、变性条件或酶抑制剂的影响。样品从反应管取出后反应即终止。样品可直接进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。因此非常适合于蛋白质体标记。IODOGEN固相管一次可制多个,并能在室温下长期保存。在SDS或Sarkosyl NL-97等变性剂存在下,IODOGEN能有效的标记各种蛋白质或多肽,所获得的放射性活度一般高于氯胺T法。 2021/9/12