免疫荧光技术课件概要.ppt

2021/9/12 * (5)镜油:一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时,必须使用镜油,最好使用特制的无荧光镜油,也可用甘油代替,液体石蜡也可用,只是折光率较低,对图像质量略有影响。 2021/9/12 * 10.荧光图像的记录方法 荧光显微镜所看到的荧光图像,一是具有形态学特征,二是具有荧光的颜色和亮度,在判断结果时,必须将两者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标,即凭工作者目力观察,作为一般定性观察,基本上是可靠的。随着技术科学的发展,采用细胞分光光度计、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜和图像分析仪等仪器。但这些仪器记录的结果,也必须结合主观的判断。 2021/9/12 * 荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要,由于荧光很宜减弱褪色,要及时摄影记录结果。方法与普通显微镜摄影技术基本相同。只是需要采用高速感光胶片如ASA200以上。因紫外线对荧光猝灭作用大,如FITC的标记物,在紫外光下照射30s,荧光亮度降低50％。所以,曝光速度太慢,就不能将荧光图像拍摄下来。一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微摄影系统装置,或用CCD与计算机联接可将图像存在软盘上。 2021/9/12 * 第七节 染色标本的保存 及封片介质的制备 2021/9/12 * 一、染色标本的保存 标本染色后应立即在荧光显微镜下观察,染色当天荧光最强。但由于种种原因,标本染色后不能及时观察,需保存。用缓冲甘油封的标本封片,保存在4℃中,过夜后特异性荧光强度减弱25％,保存1周后大约减弱 60％。如用聚乙烯醇(elvan01)封的标本,保存几周后,特异性荧光的强度才有所减少。罗达明荧光素在聚乙烯醇中溶解。因此,用罗达明标记的抗体不能用聚乙烯醇封片介质封片,但可用荧光信号增强封片剂封片,此封片介质不但能保持荧光信号不减弱,而且有增强效果。 2021/9/12 * 二、封片介质的制备 1.缓冲甘油封片介质 0.5mol／LpH8.5的碳酸盐缓冲液 10ml 无荧光甘油(AR级) 90ml 混合后在搅拌器上充分混合。 2.聚乙烯醇一缓冲甘油混合介质 0.5mol／L pH8.5的碳酸盐缓冲液 40ml 1％聚乙烯醇 10m1 分析纯甘油 10ml 2021/9/12 * 三液混合后,不断搅拌6h,7200g离心1h,吸取上清4℃保存备用。 3.荧光信号增强封片剂 mowiol 40～88 4.8g 分析纯甘油 12ml 蒸馏水 12ml 0.2mol／L Tris盐(pH8.5) 24ml 1.4—diazobicyclo—(2,2,2)—octane 1.25g (约2.5％终浓度) 2021/9/12 * 配置方法:取4.8g mowrol 40—88和 12ml甘油加入到12ml蒸馏水和0.2mol／L Tris—HCl,pH8.5的缓冲液中加热到50℃,并搅拌l0min,待完全溶解后5 000g离心 15min,取上清到小烧杯中,边搅拌边加入1.25g 1.4—diazobicyclo—(2,2,2)—octane(约 2.5％),溶解后,分装存于-20℃中。 2021/9/12 * (3)染色步骤 ①肾穿刺标本冷冻切片室温下丙酮固定 10s,PBS洗3次,每次5s; ②置切片于湿盒内分别滴加羊抗人 IgG、羊抗人IgA及羊抗人IgM抗血清,37℃ 30s; ③以PBS洗切片3次,每次5s; ④滴加兔抗羊IgG-FITC,37℃,30s; ⑤以PBS洗切片3次,每次5s; ⑥缓冲甘油封片,荧光显微镜下观察结果。 (4)结果:肾小球特异性荧光染色呈翠绿色。 2021/9/12 * 三、补体法 (一)直接检查组织内免疫复合物方法 用抗补体C3等荧光抗体直接作用组织切片,与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应,而形成抗原一抗体一补体复合物与抗补体荧光抗体复合物,在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物上补体存在处,此法常用于肾穿刺组织活检诊断等。