发酵大题范围.ppt

2021/9/12 * 基因工程菌 2021/9/12 * （三）基因不稳定性 生产的目标是得到最大量的外源蛋白,但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的,通常是致死的,失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多,从而能替代有生产能力的菌株,这就导致基因的不稳定性。 基因的不稳定性原因: 分离丢失 结构不稳定性 宿主细胞调节突变 2021/9/12 * 1、分离丢失 指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。 为什么会出现质粒丢失呢? 质粒可分为高拷贝质粒（20拷贝/细胞）和低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代细胞中有相等的分配,高拷贝质粒通常很少遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质粒,绝大多数子细胞接受一些质粒,也有可能有的细胞没有接受质粒,出现质粒丢失。虽然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百万细胞分裂中一个）。 2021/9/12 * 在大的反应器中含有非常多的细胞,总会存在无质粒细胞,例如1000L发酵液,每毫升有109个细胞,总共就有1015个细胞,那么在这个反应器中就含有109个无质粒细胞。 质粒的分离丢失受许多环境因素影响,如溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀释速率。 许多质粒也会形成多聚体,它是相同质粒附着在一起形成一个单位。 2021/9/12 * 分离丢失示意图 2021/9/12 * 2、质粒结构不稳定性 指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。如果质粒发生突变,仍保留了抗生素抗性基因,但不合成外源蛋白,那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基中生长。而且由于不合成外源蛋白,生长得比原来的工程菌更快,使得在这种培养物中带有突变质粒的菌占统治地位,这种培养情况就是结构不稳定性。 2021/9/12 * 3、宿主细胞突变 宿主细胞的突变也会造成生产能力的下降。这些突变通常改变细胞调节,结果减少目标蛋白的合成。例如,控制外源蛋白表达的启动子,利用宿主细胞的启动子,如果宿主细胞启动子的改变,将大大改变质粒编码蛋白的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子,通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG）来启动表达,如果乳糖操纵子编码半乳糖苷透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的结构类似物进入细胞,从而不能启动细胞的表达。 2021/9/12 * 4、生长速率占优势的不稳定性 所有这三种因素的关键是变异了的宿主载体系统和原宿主-载体系统的生长速率不同。如果变异了的宿主载体系统比原来的宿主-载体系统有生长优势,那么变异了的系统将最终占优势,基因不稳定性就出现。 （四）表达的诱导 基因工程菌的产物表达需要诱导,诱因主要有:温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。 2021/9/12 * 提高质粒稳定性的方法 1、两阶段培养法:第一阶段使菌体生长至一定密度,第二阶段诱导外源基因的表达。在培养基中加入选择性压力如抗生素等,以抑制质粒丢 失菌的生长。 2、通过控制环境参数（温度、PH、培养基组分和溶解氧浓度）,调节比 生长速率,使工程菌生长具有优势。有些含质粒的菌对发酵环境的改变 比不含质粒的菌反应慢,因而间歇改变培养条件以改变这两种菌的比 生长速率,可以改善质粒的稳定性。 2021/9/12 * 染菌 2021/9/12 * 3、不同时间染菌对发酵的影响 污染时间是指用无菌检测方法确准的污染时间,不是杂菌窜入培养液的时间。 杂菌进入培养液后,需有足够的生长、繁殖的时间才能显现出来,显现的时间又与污染菌量有关。污染的菌量多,显现染菌所需的时间就短,污染菌量少,显现染菌的时间就长。 2021/9/12 * （1）种子培养期染菌 由于接种量较小,生产菌生长一开始不占优势,而且培养液中几乎没有抗生素（产物）或只有很少抗生素（产物）。因而它防御杂菌能力低,容易污染杂菌。如在此阶段染菌,应将培养液全部废弃。 2021/9/12 * （2）发酵前期染菌 发酵前期最易染菌,且危害最大。 原因 发酵前期菌量不很多,与杂菌没有竞争优势;且还未合成产物（抗生素）或产生很少,抵御杂菌能力弱。 在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。 染菌措施 可以用降低培养温度,调整补料量,用酸碱调pH值,缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌,且培养基养料消耗不多,可以重新灭菌,补加一些营养,重新接种再用。 2021/9/12 * （3）发酵中期染菌 发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸,培养液pH下降;糖、氮消耗快,发酵液发粘,菌丝自溶,产物分泌减少或停止,有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭,产生大量泡沫。 措施 降温培养,减少补料,密切注意代谢变化情况。如果