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SRY基因的检测精会计学原理1聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）的基本原理是，通过热变性使目的DNA（模板DNA）双链解开；通过退火将引物复性结合到它们的互补位置；通过DNA聚合酶延长引物，反复循环体外扩增出大量一对引物之间的DNA片段。 聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction（PCR）一种可以将目的微量的DNA片断扩增100万倍以上的技术Mullis (1993)染色体PCR 可以把 指定的基因片段 数量放大百万倍PCR基本工作原理以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板3’和5’端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制延模板链延伸直至完成新的DNA合成。重复这一过程，可使目的DNA片段得以扩增。 PCR体系基本组成成分模板DNA特异性引物一对分别与待扩增DNA序列两端互补的寡核苷酸片段。耐热DNA聚合酶Tag DNA聚合酶dNTPs含Mg2+的缓冲液PCR基本反应步骤使模板DNA完全变性成单链。同时引物自身和引物之间存在的局部双链得以消除三个步骤为一个循环，每次循环产物作为下一轮模板进入下一轮循环变性95?C使引物和模板DNA退火结合此温度下DNA聚合酶以dNTP 为底物催化DNA链的延长循环25-30次退火Tm-5?C延伸72?C5/3/℃3/5/9590858075706560555/5/504540355/5/30变性（95℃）引物A退火（60℃）引物B第一轮循环延伸（72℃）DNA-PolDNA-Pol温度5/3/3/5/9590858075706560555/5/5/5/504540355/5/5/5/30变性（95℃）引物A退火（60℃）第二轮循环引物B延伸（72℃）DNA-Pol℃DNA-PolDNA-PolDNA-Pol温度℃5/5/955/5/90858075705/65605/555/50455/403530变性（95℃）退火（60℃）第三次循环延伸（72℃）DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol温度5/3/3/5/DNA样品引物A引物B待扩增序列基因组DNA5/3/3/5/第四次循环第三次循环第一次循环第二次循环PCR的主要用途1、与反转录结合，直接从组织细胞中的mRNA 获得目的基因；2、利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得目的基因片段；3、利用简并引物从cDNA 文库或基因组文库中获得具有一定序列相似性的基因片段；4、利用随机引物从cDNA文库中克隆基因。利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的DNA的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。目的基因的克隆基因的体外突变PCR的用途利用PCR结合其它技术，可以提高基因突变检测的敏感性。基因突变分析DNA序列测定DNA和RNA的微量分析PCR技术高度敏感，对DNA的含量要求很低。理论上只要存在一分子的模板就可以获得目的片段。RNA需要反转录。原理2 人类个体的表型性别是由Y染色体决定的,具体地说是由Y染色体上编码睾丸发育的睾丸决定因子(testis determining factor,TDF)基因所决定，TDF基因的存在决定着睾丸的发育，即决定个体发育为男性。研究表明TDF基因位于Y染色体短臂与拟常染色体相接的35kb区域，该区域又称为Y染色体性别决定区（sex determining region of the Y，SRY）。 。 3 在SRY基因区域设计特异的引物，如果能够利用PCR技术体外扩增出SRY基因片段，即可判断为男性，否则为女性。本实验在SRY基因区域内设计了一对引物，利用引物Y1.5/ Y1.6扩增出一239bp的片段。4 利用PCR技术扩增SRY基因片段检测性别具有广泛的实际应用价值，如结合细胞遗传学的核型分析，通过确认SRY所在区域的缺失或易位，诊断46，XY女性或46，XX男性性反转综合征的患者；通过检测胎儿的性别，预防甲型血友病、G6PD缺乏症等X连锁隐性遗传病患儿的出生； 5 通过骨髓移植后Y染色体特异的SRY基因片段的DNA分析是由阳性转为阴性或相反，来判断异性别的骨髓移植程度；多年尸块的DNA常有降解，而PCR只分析DNA的一小部分，不受降解的影响，因此本实验技术常应用于法医学上尸块或血斑的性别确定；此外，本实验还可用于需要快速、准确、同时需检查大量标本的运动员体检。 一、?由微量外周血标本制备模板DNA 试剂与材料： 1、 细胞裂解缓冲液 （SDS ；蛋白酶K ）　2、酚：氯仿：异戊醇（25：24：1体积比） 　 3、3mol醋酸钠（PH5.2）　 4、无水乙醇，-20℃保存　 5、70%乙醇，-20℃保存 6、TE缓冲