羊肚菌生产菌株栽培适宜性评价系统.docx

羊肚菌生产菌株栽培适宜性评价系统 0 引言羊肚菌（菌种是羊肚菌人工栽培的关键。2015年之前，全行业每年约有30%~40%的栽培面积不出菇或出菇极差，一个重要的原因是推广使用了非可栽培种类如黑脉羊肚菌（1 羊肚菌菌株身份识别1.1 确定羊肚菌潜在栽培菌株分类地位的必要性羊肚菌子囊果形态多变，容易受到环境条件的影响，因此羊肚菌属以下的分类一直是个难题1.2 羊肚菌菌株身份识别方法虽然构建多基因系统发育树是羊肚菌物种鉴定的标准（1）菌丝体纯培养：将活化培养的菌株菌丝块接种在CYM（葡萄糖 20 g，酵母膏 2 g，蛋白胨 2 g，K（2）基因组DNA提取：将菌丝体加入液氮研磨成粉末；取约50~100 μL体积粉末，加700 μL裂解液（CTAB 2%，PVP 2%，Tris-HCl 100 mM，EDTA 20 mmol/L，NaCl 1.4 mol/L）60~65 ℃裂解20 min，12 000 r/min离心10 min；上清液加入等体积的PCA（苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1），颠倒混匀后12 000 r/min离心10 min；上清液加入等体积CA（氯仿:异戊醇=24:1），颠倒混匀后12 000 r/min离心10 min；上清液加入1/10体积3 mol/L 乙酸钠溶液，再加入2倍体积的无水乙醇，置－20 ℃ 30 min沉淀DNA；12 000 r/min离心5 min获得DNA沉淀，用约1 mL 75%乙醇清洗盐离子后，DNA沉淀再用含1% RNase A的TE缓冲液（Tris-HCl 10 mmol/L，EDTA 1 mmol/L）溶解，37 ℃水浴 1 h消解RNA，最终获得高质量DNA母液。采用紫外分光光度计测定母液的浓度，然后将母液稀释为DNA含量为 50 ng/μL的工作液，4 ℃储存备用。（3）PCR扩增：选择ITS通用引物ITS（4）测序分析：PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测合格后（黑色羊肚菌类群菌株条带大小约800 bp；黄色羊肚菌类群菌株条带大小约1 200 bp），直接送测序公司进行双向测序。（5）数据库比对：获得测序结果，检测测序质量，剔除两端的低质量碱基，拼接获得完整的ITS序列；提交至NCBI数据库（/）进行blastn比对，初步确定样品的分类地位。（6）系统发育树的构建：下载可信的参考ITS序列，使用MEGA、PAUP或MrBayes等软件构建菌株系统发育树，初步确定研究菌株的分类地位。2 羊肚菌菌株交配型基因测定2.1 测定羊肚菌潜在栽培菌株交配型的必要性同宗结合还是异宗结合是羊肚菌生活史的关键环节我们检测了不同地区来源的3个梯棱羊肚菌、5个七妹羊肚菌和11个六妹羊肚菌菌株栽培出菇的子囊果和3个野生高羊肚菌子囊果共计22份样品24批次组织分离的348份分离物的交配型基因结构，发现其中151份分离物只检测到一种交配型基因，整体交配型基因的缺失率为43.4%2.2 羊肚菌交配型基因测定方法多个团队发表了羊肚菌交配型基因的检测方案（1）羊肚菌交配型基因特异性引物：Mat1-1-1TF/R：AAAACGCTCTATCGCCACCA/ TGCGAAGTTGCGTTTTCAGG，Mat1-2-1TF/R：ATGAAGGCTGTTCGCCAGAA/ TGGTGCTCTCGTGCAGATTT，分别扩增Mat1-1和Mat1-2基因，目的片段大小分别为412 bp和291 bp，可以很好地用于梯棱羊肚菌、七妹羊肚菌、六妹羊肚菌和（2）PCR扩增：PCR反应体系同“1.2”的PCR体系，或者采用如下的体系：PCR MIX 1×（包含dNTPs、Mg（3）电泳检测和结果判断：PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳电泳检测，记录扩增条带的有无和大小，Mat1-1-1和Mat1-2-1片段大小正确且同时存在视为该菌株具有完整的基因型，否则视为某一种交配型缺失菌株。3 羊肚菌菌株老化与活力测定3.1 羊肚菌菌株老化表现及菌株活力测定的必要性相对于酿酒酵母（3.2 羊肚菌菌株活力测定方法目前，羊肚菌菌株活力评价主要依靠培养特征。继代培养是综合评价羊肚菌菌株老化的简便、可靠方法，能直观反映初始菌株的寿命（总继代培养时长和总生长距离）和活性状态（菌丝长速、菌核和色素产生等）。3.2.1 菌株继代培养和培养特征观察 （1）培养基：CYM固体培养基。（2）大平板制作：直径15 cm的大培养皿灭菌后倾注40 mL CYM固体培养基，凝固后使用。（3）接种与培养：在平板的一侧距离边缘1.5 cm处接种初始菌株菌丝块，23 ℃避光培养，每2 d在菌落前端划线，记录生长距