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GB 4789.3-2016大肠菌群MPN计数法方法学验证报告
验证目的
验证GB4789.3-2016《食品微生物学检验 大肠菌群计数(MPN计数法)》在本实验室的适用性。
二、验证方法
本实验样品取不同品牌或者同一品牌不同类型产品进行实验,严格按照GB4789.3-2010进行,本实验方法设计如下:
样品种类
样品名称
样品编号
实验人员
实验方法
蜂蜜
A
XXXX
a、c
双人双平行
蜂蜜
B
XXXX
b、a
双人双平行
蜂蜜
C
XXXX
c、b
双人双平行
除上述实验程序外,为保证本次验证的科学性和准确性,本次实验添加阳性对照组,对照组由标准菌株大肠埃希氏菌(CICC10389)接种培养而成,与样品实验程序同时进行。
三、验证设备和试剂
冰箱:BCD-212DG/A 海信(北京)电器
生化培养箱:LRH-70 上海一恒科学仪器
电位pH计:PHS-3C+(精确度0.01) 成都世纪方舟科技有限公司
无菌均质器:SCIENTZ-04 宁波新芝生物科技有限公司
恒温振荡器:SHA-A 江苏金坛环宇科学仪器厂
菌落计数仪:Scan-500 北京五洲东方科技发展有限公司
天平:JE-502 上海浦春计量仪器有限公司
超净工作台:SW-CJ-2FD 上海博迅实业
培养基和试剂:
月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤 北京陆桥技术股份有限公司
煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤 北京陆桥技术股份有限公司
无菌 1 mol/L NaOH:同GB 4789.3项下制法。
无菌 1 mol/L HCl:同GB 4789.3项下制法。
无菌生理盐水:同GB 4789.3项下制法。
四、验证环境
依据《消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995》定期对高压蒸汽灭菌锅的灭菌效果进行检测评价并记录;
依据《无菌室消毒灭菌操作规程》定期对对无菌室、超净台进行清洁消毒灭菌并记录;
依据《实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T27405-2008》定期对对无菌室及超净台进行沉降菌检测并记录;
无菌室检验:详见《xxxx》;
五、验证步骤
样品的稀释
1.1 固体和半固体样品: 称取 25 g 样品放入盛有 225 mL生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打 1 min~2 min,制成 1:10 的样品匀液。
1.2 液体样品:以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成 1:10 的样品匀液。
1.3 样品匀液的 pH值应在 6.5~7.5 之间,必要时分别用 1 mol/L NaOH或 1 mol/L HCl 调节。?1.4 用 1 mL微量移液器吸取 1:10 样品匀液1 mL,沿管壁缓缓注入 9 mL生理盐水的无菌试管中,振摇试管使其混合均匀,制成 1:100 的样品匀液。
1.5 根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次,换用1支 1 mL 无菌吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过 15 min。
初发酵试验
每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1 mL,则用双料LST肉汤),单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤和双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤阳性对照和空白对照各接种一管。36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h,观察倒管内是否有气泡产生,24 h±2 h产气者进行复发酵试验,如未产气则继续培养至48 h±2 h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环, 移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB) 管中,36℃±1 ℃培养48h±2h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。
大肠菌群最可能数(MPN)的报告
按3确证的大肠菌群LST阳性管数,检索MPN表(见附录B),报告每g样品中大肠菌群的MPN值。
六、验证结果
实验结果如下表所示,详细实验结果见《食品中大肠菌群MPN计数检验原始记录(2010)》。
表1:大肠菌群MPN计数检验(2010)实验结果统计表
组别
样品名称
和编号
实验员
实验结果
平行
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