9.工业微生物育种.ppt

9.工业微生物育种 ;●工业微生物的来源：;●分离微生物新种的基本步骤：;①采样 从自然界种采集含目的菌的样品;例：醛肟水解酶的筛选;—水分 ⅰ.离地表5-25cm土样 ⅱ.含水过多、过少都不理想 —温度：采样以秋季为好 —通风: —植被：根部分泌物对微生物分布的影响 —酸碱度： 细菌、放线菌：中性或偏碱； 霉菌、酵母：偏酸;★采样方法 ⅰ.去除表层土 ⅱ.取5-25cm土样10-25g，装入无菌牛皮纸袋 或塑料袋中 ★注意 ⅰ.记录：时间，地点，环境情况等 ⅱ.样品袋应封好口，防止水分失去 ⅲ.土样应在分离前破碎 ⅳ.尽快分离;②增殖培养（富集培养）;★ 控制营养成分 ?? —纤维素为唯一碳源，可增殖分解纤维素的菌 —可溶性淀粉为唯一碳源，可增殖产淀粉酶的菌种 —酒精废水，可以增殖废水利用菌 注：多种微生物所利用的碳/氮源不能作控制因素 ★ 控制培养基pH —细菌、放线菌：中性偏碱， —真菌：偏酸 注：但非目的菌的生长不能被完全抑制;★ 控制培养温度 —30℃左右培养，可培殖嗜温微生物 —50～60℃培养，可培殖嗜热微生物，筛选耐热菌株 ★ 热处理—增殖芽孢细菌 样品悬浮液经80℃、10分钟处理，杀死营养体，再添加营养培养后可增殖产芽孢细菌;★ 添加抑制剂 —10%酚数滴：抑制细菌霉菌生长，增殖放线菌 —抗生素：抑制细菌放线菌，增殖酵母、霉菌 —多粘菌素B：抑制G-细菌 —青霉素：抑制G+细菌 —制毒菌素：抑制真菌 —放线菌酮：抑制真菌 ;③纯种分离;稀释分离倾注平板;划线分离法; — 组织培养法; ⅰ.纸片培养显色法 滤纸饱浸含有指示剂的液体培养基 用接种环接种 保湿恒温培养 据菌落周围变色圈和菌落直径比值判别目的物产量 ⅱ.透明圈法 根据琼脂培养上透明圈/菌落直径大小判别目的产物的产量 淀粉平板透明圈：淀粉酶 碳酸钙平板透明圈：产酸 酪素（蛋白）透明圈：蛋白酶;ⅲ.变色圈法 淀粉平板喷稀碘液：透明圈，液化型淀粉酶 支链淀粉平板喷稀碘液： 蓝色圈：异淀粉酶 无色圈：液化型淀粉酶 葡聚糖平板加刚果红：葡聚糖酶 木聚糖平板加刚果红：木聚糖酶;变色???反应;ⅳ.生长圈法 工具菌： 营养缺酸型，不能合成的物质（生长因素）为目的菌积累的产物 菌落形态明显不同于目的菌 方法：106~107 工具菌与样品稀释液一起涂布至琼脂培养基表面，具有生长圈的菌落即为目的菌 适用：氨基酸，核苷酸，维生素产生菌的选育;ⅴ.抑制圈 适用：抗生素产生菌的选育 工具菌：对目的抗生素敏感的微生物 例：目的菌为产生抗G+细菌的抗生素的菌株 工具菌可使用金黄色葡萄球菌 方法 目的菌分离：稀释分离法，培养长出菌落 代谢物积累：用打孔器（6CM）将菌落连同周围琼脂培养基一起取下，放一无菌空培养皿内，保湿培养4-5天，使新产生抗生素积累于小琼脂块中 测定：取107工具菌涂布于球脂培养基，将小琼脂块放于上面培养过夜，抑菌圈的出现，说明琼脂块中有抗生素，大小说明抗生素单位的高低;琼脂块培养法筛选抗生素产生菌程序;包含某种指示剂的固体培养基的滤纸片变色圈。;;④厌氧性微生物的分离法 ⅰ.去除培养基中的溶解氧，降低Eh 煮沸法：将培养基置沸水中煮沸15分钟，驱除其中的溶解氧，勿再摇动，Eh可降至0.1V 以下 培养基预还原：将培养基中加入还原性物质：半胱氨酸，巯基化生物，Na2S，抗坏血酸等降低Eh;ⅱ.创造无氧环境 物理除氧 空气置换法：干燥器或厌氧培养罐 抽真空 76mmHg→充入N2 （反复3次）→充入CO2 10% +H2 10% + N2 80% 化学除氧 H2 + O2 → H2O (钯作催化剂） GASPAK罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氢钠化学反应产生H2 和CO2，H2与O2反应生成水 厌氧指示剂;ⅲ.厌氧分离（培养）技术 高层琼脂柱技术 厌氧罐技术 厌氧手套箱技术 ;⑤ 筛选 —初筛：通风发酵菌种，通过摇瓶发酵进行，每 株一瓶 目的：淘汰80%-90%的分离菌株中的低产菌 培养条件：主要通过查阅资料及需要而预先决 定，如培养基组成，通风量（装液 量，摇瓶机转数），pH、温度、培 养时间等。 分析测定：最好定量，如较困难时可采取半定 量方法;—复筛：每株3-5瓶，可提前培养种子，使接种 量比较一致，3-5%接种量， 培养条件可同初筛 分析测定：定量，注意副产物 ; 初筛和复筛的比较;⑥培养工艺条件试验与生产试验 —摇瓶发酵