胆汁酸作用于肝癌差异表达基因和蛋.doc

胆汁酸作用于肝癌细胞的差异表达基因与蛋白谱研究 立项依据及研究内容（4000-8000字）： 1.立项依据 恶性肿瘤是当前危害人类健康的主要疾病之一，全世界每年约700万人死于肿瘤。肝癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，约占人类肿瘤的6％，每年约50万人死亡，中国占了42.5％。目前对肝癌的治疗尚未有重大突破，用常规的治疗方法目前还不能治愈。近年来研究表明肿瘤致病机理主要是细胞过度增殖、调亡不足和分化受阻，因此寻找抑制肿瘤细胞的恶性增殖、诱导分化和促进调亡的药物受到研究者们的广泛关注。同时，从天然产物中寻找有效活性成分也是当今抗肿瘤药物的发展战略之一。 胆汁酸是胆烷酸衍生物，直接由胆固醇转变而来，在肝分泌的胆汁酸中胆汁酸多与甘氨酸或牛磺酸结合形式存在，称为结合型胆汁酸，并且有与Na或K结合成盐，即为胆汁酸盐。结合型胆汁酸中又以甘氨结合型胆汁酸为主，甘氨酸与牛磺酸比值为4：1。由胆固醇在肝细胞内直接转变而成的胆汁酸属于初级胆汁酸，初级胆汁酸随胆汁排入胆道，经肠道细菌作用，在第七位脱去羟基，转变为脱氧胆酸和石胆酸，称为次级胆汁酸。然后经肠肝循环重新吸收入肝并继而进入胆汁。在人类胆汁中的胆汁酸（游离型）主要有胆酸（CA）、 鹅脱氧胆酸（CDCA）、脱氧胆酸（DCA）和少量的熊脱氧胆酸（ UDCA）、 石胆酸（LCA） 组成，其比例为13：10：6：1。胆汁酸分为亲水性和疏水性两大类，现已证明高浓度疏水性胆汁酸对肝脏有极强的损伤作用，但机理尚不清楚。既往研究发现，食物中添加脱氧胆酸钠或胆酸钠可使鼠在数天内死亡，若一次管饲15%胆酸钠4. 8ml/kg，则鼠在24小时内死亡，说明大剂量胆汁酸有急性毒性作用。一定浓度范围的胆汁酸使生物膜的磷脂和蛋白质脱落，起膜损害作用，引起细胞膜通透性增加，进而导致细胞的凋亡或者死亡。体外研究表明，胆汁酸对培养的肝细胞、胃肠粘膜上皮细胞和心血管内皮细胞等均有细胞毒作用，且作用强度与浓度和时间呈正相关，研究表明低浓度疏水性胆汁酸诱导肝细胞凋亡与线粒体结构和功能损害、ATP合成抑制引起细胞能量代谢障碍和脂质过氧化有关。近年来研究表明胆汁酸能抑制肿瘤细胞增殖和促进凋亡，低剂量的CDCA抑制人肝癌细胞系HepG2增殖，引起线粒体膜电位降低和ATP耗竭，诱导细胞凋亡[1]。TUDCA通过MAPK p42/44、PKC-α和Ca2+ 信号转导途径抑制人胆管癌细胞系Mz-ChA-1 增殖[2]。 最新研究表明胆汁酸衍生物对肿瘤细胞作用效果尤为明显， UDCA 衍生物 HS-1030 ，HS-1183和CDCA 衍生物 HS-1199，HS-1200 能抑制人结肠癌细胞系HT-29，胃癌细胞系SNU-1，人前列腺癌细胞系PC-3，肥大细胞瘤细胞系P815等细胞增殖，降低线粒体膜电位，活化caspase，诱导细胞凋亡。同时细胞周期素(cyclin)，细胞周期素依赖蛋白激酶(cyclin-dependent kinase)，细胞周期素依赖蛋白激酶抑制剂(cyclin-dependent kinase inhibitor),信号转导蛋白等蛋白表达明显改变[3-6]。 我们前期研究证实了疏水性胆汁酸GDCA能明显诱导肝细胞的凋亡，引起肝细胞的脂质过氧化，激活磷脂酶A2（s PLA2）和细胞内钙离子浓度的增加。低浓度胆汁酸对肝癌细胞SMMC7721有增殖抑制作用，能引起细胞凋亡、细胞周期、信号传导以及端粒酶的一些相关基因与蛋白的改变, 但其作用机理尚不清楚。目前，国内外对胆汁酸作用肝癌细胞SMMC7721及其机制的研究尚未见报道。因此，有必要对胆汁酸作用肝癌细胞SMMC7721及其机制进行进一步研究。 目前抗肿瘤药物作用机制研究大多都停留在探讨常见基因mRNA或蛋白表达的变化，这样很难从整体上全面的分析药物的作用机制。研究表明通过细胞mRNA和蛋白表达谱的改变来判断药物的治疗效果和探讨其机制是可行的[7] 同时进行mRNA和蛋白质差异表达谱研究药物作用机制可得到用单一方法难以获得的、具有明显互补性的结果，对探讨药物作用机制有重要意义。 细胞mRNA表达谱差异研究方法很多，目前最常用的是1996年建立的mRNA抑制性消减杂交技术（suppression subtractive hybridization, SSH），SSH技术是一种比较和分离不同细胞或同一细胞在不同状态下差异表达基因的方法。它以抑制性PCR 为基础，将标准化检测子cDNA单链步骤和消减杂交步骤相结合，对两组cDNA片段进行比较，获得差异表达的基因片段，抑制性PCR是利用非目的片段两端接头上具有反向重复序列，根据链内退火优于链间退火的原理，在PCR扩增时产生类似“锅-柄”样互补结构，无法作为模板与引物配对，从而选择性的抑制非目的基因片段的扩增，消减杂交步骤去除了