分子生物学(10个主干实验)步骤.docx

PAGE PAGE # 生物学实验四》实验操作步骤 2010年3月 实验一、细菌培养、细胞培养 大肠杆菌培养 大肠杆菌是以 DNA 扩增或者以表达外源基因为目的最常用的基因工程菌。 将含有目的基 因的重组质粒或重组噬菌体导入大肠杆菌，并将该大肠杆菌在合适的培养基中培养、增殖， 就可扩增目的基因。 大肠杆菌培养包括固体和液体培养基的制作，平板培养、复壮培养和大量液体培养。根 据培养目的分为 DNA 扩增培养和蛋白质的表达培养。 分子生物学实验使用的大肠杆菌主要是 K12 株的衍生菌株，用于重组的常用菌株有 HB101、JM109、DH 5α等,用于表达的常用菌株有 BL 21( DH 3)等。 大肠杆菌培养的操作大多在超净工作台内进行。超净工作台内常用的主要实验器具有： 培养皿、培养试管、培养瓶、移液枪、白金接种环、接种棒、竹针、牙签、煤气灯或酒精灯 等。超净工作台使用前要用 70%酒精和紫外灯消毒。 大肠杆菌的最适培养条件也是大多数霉菌和其它细菌的最适生长条件，为此，一切大肠 杆菌培养用的试剂和器具必须灭菌。 灭菌的方法有高压蒸气灭菌、 干热灭菌、火焰灭菌、紫 外线和酒精杀菌等。 蒸气高压灭菌前， 洗净的器具以及培养基等要用铝膜、 牛皮纸等包裹好， 灭菌条件为 121℃， 20min 。 平板制作：打开培养瓶塞，摇匀培养基，将培养瓶口在酒精灯上消毒，打开灭过菌的培 养皿，分注培养基，培养基凝固后倒置培养皿，用灭菌口袋或牛皮纸包装后 4℃冷却备用。 划线培养：将白金接种环在酒精灯上消毒，冷却后将白金接种环前端轻沾菌液后在固体 平板培养基表面划线接种。倒置培养皿 37℃培养一夜。 液体培养： 用灭菌牙签在平板培养基上挑选单菌落，将沾有单菌落的牙签放入 2～3ml 培 养基的培养试管内， 37℃、 200～ 250 r/ min 振荡培养一晚( 8～16 小时)。复壮后的菌株 可进一步大量液体培养，用于质粒大量扩增或蛋白质表达。取 2～3ml 经复壮的菌液放入 装有 200～300ml 培养基的锥形瓶内扩大培养， 37℃、 200～250 r/ min 振荡培养至 OD 600 为 0.6 左右。 昆虫细胞培养 详见《昆虫细胞培养》多媒体 实验二、昆虫病毒 DNA 的分离、纯化和鉴定 1、2 ml 病毒感染的培养细胞悬浊液 ↓ 8000 r/min 4 ℃ 10min ，去上清 2、 加 PBS 漂洗混匀 ↓ 8000 r/min 4 ℃ 10min ，去上清 3、加 250μ lTE 悬浊 ↓ 4、加 250μlLysis Buffer 裂解细胞 ↓ 5、 加 20μ lProteinase K ( 10mg/ml ) ↓ 50 ℃ 4h /37 ℃ 过夜 6、加 3μ lRNase A( 10mg/ml ) ↓ 37 ℃ 30 min 7、 加等体积酚 -氯仿 ↓ 12000 r/min 4℃ /10min 取水相(剪枪头，烤平) 8、重复步骤 7 9、水相加 1/10 体积 3mol/L NaAC (pH4.8 ) ↓ 10 、加 2 倍体积的无水乙醇沉淀病毒 DNA ↓-20℃，过夜 ↓ 1200 0r/min 4℃ /5min ，去上清 11、 70% 乙醇洗涤沉淀 ↓ 1200 0r/min 4℃ /5min 去上清 12 、重复步骤 11 13 、适量 TE 溶解 ↓ 14、电泳鉴定 实验三、 PCR 扩增昆虫杆状病毒基因及其产物的鉴定 1.PCR 反应体系 : TOC \o 1-5 \h \z TaqDNA 聚合酶 0.5μl 10 ×PCR Buffer 5μl dNTP 4μl Template（病毒基因组 DNA） 1μl Primer1 1μl Primer2 1 μl ddH2O 37.5μl Total 50 μl 2、 PCR 反应程序： 94 ℃ 3min 94 ℃ 30s 55 ℃ 30s 72 ℃ 1min 72 ℃ 10min 4 ℃ forever 35 cycles 实验四、质粒 DNA(pMD-B7-2 ScFv和 pET32a) 的分离、纯化和鉴定 将菌株接种于 LB液体培养基中， 37℃振荡培养过夜 4. 碱法少量快速抽提质粒 ↓ DNA（详见 4） ↓ ↓ 2. 取 1.5ml 培养物倒入 Eppendorf 管中， 4℃ 3000r/min 离心 5min ↓ 3. 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥 5. 质粒 DNA 的琼脂糖凝胶电泳鉴定（详见 5） 4. 碱法少量快速抽提质粒 DNA 单菌落 ↓接种 3ml LB 培 养基 （含 Amp或 Kan 100ug/ml ） ↓ 37℃ 200rpm 振荡过夜培养 Sup add ↓ 等体积酚：氯仿（ 1： 1） ↓混匀