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DNA重组技术概述天津科技大学：罗学刚 第一节 DNA的重组 DNA Recombination基因表达的分子生物学基础原核细胞的基因是由成百上千个核苷酸对组成的。组成基因的核苷酸序列可以分为不同区段。在基因表达的过程中，不同区段所起的作用并不相同。有的区段能够转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成，也就是说能够编码蛋白质的区段叫做编码区。有的区段不能转录为信使RNA，也就是说不能编码蛋白质的区段叫做非编码区。一个典型的原核细胞基因结构示意图真核细胞的基因是由编码区和非编码区两部分组成的。在非编码区上，同样有调控作用的核苷酸序列，但是真核细胞的基因结构要比原核细胞的基因结构复杂。与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是：编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。其中，能够编码蛋白质的序列叫做外显子，一般不能够编码蛋白质的序列叫做内含子。一个典型的真核细胞基因结构示意图转录终止点转录起始点外显子2外显子1外显子3AATAAA增强子TATA框内含子1内含子23’5’CAAT框真核细胞基因结构示意图启动子：主要包括两个序列（1）在5’端转录起始点上游约20~30个核苷酸处有TATA框，它是一个短的核苷酸序列，是启动子中的一个顺序，它是RNA聚合酶的重要接触点，能使酶准确识别转录的起始点并开始转录。当TATA框中的碱基顺序有所改变时，mRNA的转录就会从不正常的位置开始。转录终止点转录起始点外显子2外显子1外显子3AATAAA增强子TATA框内含子1内含子23’5’CAAT框真核细胞基因结构示意图启动子：主要包括两个序列（2）在5’端转录起始点上游约70~80个核苷酸的地方，有CAAT框，是启动子中另一个短的核苷酸序列，是RNA聚合酶的另一个结合点，它的作用还不肯定，一般认为它控制着转录的起始频率，而不影响转录的起始点。当框中的碱基顺序改变后，mRNA的形成量会明显减少。转录终止点转录起始点外显子2外显子1外显子3AATAAA增强子TATA框内含子1内含子23’5’CAAT框真核细胞基因结构示意图增强子：在5’端转录起始点上游约100个核苷酸以远处的位置，能使转录活性增强上百倍。终止子：在3’端终止密码的下游有一个核苷酸顺序为AATAAA，AATAAA顺序和下游的反向重复顺序合称为终止子，是转录终止的信号。终止子的特殊碱基排列顺序能够阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来。3’5’ATT AAAGGCTCC TTTT GGAGCCTTT TTTTTTAA TTTCCGAGG AAAA CCTCGGAAA AAAAA3’5’转录UU模板链UUCGGCUACGGCCGAUAU5’3’AUUUUU反向重复顺序某基因终止子的反向重复顺序与发卡结构的形成图解UAUUDNA重组包括：同源重组细菌的基因转移与重组位点特异重组转座重组接合作用转化作用转导作用一、同源重组发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。受体四、转座重组 由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座（transposition）。 第二节 重组DNA技术 DNA Recombination Technique基因工程诞生的历史背景： 1973年是基因工程诞生的元年。1. 1944年Oswald T.Avery等的肺炎球菌转化证明了DNA是遗传信息携带者。2. 1953年James Watson和Francis Crick 两人提出了DNA结构的双螺旋模型，揭示了遗传物质自我复制的机制。3. 1961-1965年,科学家破译了生物界全部64个遗传密码,发表了划时代的遗传密码字典，提出了遗传信息由DNA→RNA→蛋白质传递的中心法则。4. 1970年发现了反转录酶，丰富了中心法则，为cDNA的制备奠定了基础。5. 染色体外DNA质粒的深入研究，为第一批重组DNA载体提供了材料。6. 1968-1970年，限制性内切酶的发现和纯化，为DNA的体外重组提供了有力的工具。7. 1972年，Berg.D等人首次用限制性内切酶EcoRI切割噬菌体和SV40病毒DNA分子，将这两种不同来源的DNA片段成功地在体外连接成杂合DNA分子。 至此，用重组DNA技术改变生物学性状的尝试在1973年由Cohen等人完成。从此，这项技术为生物学带来了一场深刻的革命，这类技术本身也迅速地发展起来，并广泛地渗透到各个学科的研究领域。 一、重组D