黄栌枯萎病菌VdKss1的功能研究.pdf

摘要 摘要 近年来黄栌枯萎病在我国华北多地发生，引起叶片萎蔫，甚至全株死亡，已造成 严重的经济和生态效益损失。黄栌枯萎病的病原为大丽轮枝菌 （Verticillium dahliae Kleb. ），是一种土传性植物病原真菌。大丽轮枝菌形成的微菌核是一种抗逆性极强的 休眠结构，在侵染循环中发挥非常重要的作用，因此，阐明微菌核形成机制对揭示黄 栌枯萎病发病规律和制定有效防治措施具有重要的理论意义和实践价值。该病原菌 Kss 1-MAPK 信号途径的VdSte11 和VdSte7 已被证实调控微菌核形成和致病过程，而 VdKss1 的生物学功能尚不明确。本研究采用功能基因组学研究方法开展了黄栌枯萎 病菌VdKss 1 的生物学功能分析。主要结果如下： 1.黄栌枯萎病菌VdKss1 影响分生孢子的形成：VdKss 1 的缺失不会影响生物量， 但会导致分生孢子的产量增多和气生菌丝减少。 2.黄栌枯萎病菌 VdKss1 调控黑色素化微菌核的形成：敲除 VdKss 1 导致了病原 菌微菌核结构的缺陷，微菌核变小，且黑色素的积累明显减少。 3.黄栌枯萎病菌 VdKss1 敲除突变体丧失致病性：VdKss1 的缺失导致突变体不能 形成侵染结构，无法穿透赛璐玢膜和洋葱表皮组织，失去对寄主植物的致病性，表明 VdKss1 在致病过程中起关键作用。 本研究明确了VdKss1 调控黄栌枯萎病菌生长发育、微菌核形成和致病过程，完 善了大丽轮枝菌Kss 1-MAPK 途径核心组分的功能研究，为进一步研究提供了遗传材 料和数据支撑，也为阐述黄栌枯萎病菌MAPK 信号传导网络奠定了基础。 关键词：黄栌枯萎病，大丽轮枝菌，微菌核，Kss 1，MAPK I 目录 目录 1 引言 1 1.1 真菌中的MAPK 信号途径 1 1.1.1 MAPK 信号途径概述 1 1.1.2 Kss1-MAPK 信号通路概述 3 1.1.3 Kss1-MAPK 信号通路与其它MAPK 通路的关系 6 1.2 黄栌枯萎病菌中的MAPK 信号途径7 1.2.1 黄栌枯萎病的危害及病原菌7 1.2.2 大丽轮枝菌的生物学特性及致病机理 8 1.2.3 黄栌枯萎病菌中的MAPK 信号途径 8 1.3 研究目的与意义 10 1.4 研究内容和技术路线 11 2 材料与方法 13 2.1 供试菌株及培养条件 13 2.2 培养基 13 2.3 PCR 引物 13 2.4 VdKss1 基因的生物信息学分析 13 2.5 VdKss1 基因敲除与互补载体的构建 13 2.5.1 基因组DNA 的提取 13 2.5.2 敲除载体和互补载体的构建 14 2.5.3 VdKss1 基因互补载体的构建 15 2.5.4 黄栌枯萎病菌PEG 介导的原生质体转化 15 2.5.5 突变体的筛选及验证 16 2.5.6 互补突变体的筛选和验证 16 2.6 突变体表型验证 17 2.6.1 菌落和菌丝生长表型测定 17 2.6.2 分生孢子产量 17 2.6.3 黑色素和微菌核观察 17 2.6.4 致病性接种试验 18 2.6.5 穿透能力测定 18