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e10-1 天冬氨酸蛋白酶与金属蛋白酶
天冬氨酸蛋白酶的催化机制一般可分为以下几步:
1. 水和多肽底物进入两重对称的活性中心。
2. 两个Asp残基的羧基具有不同的pKa。pKa高的Asp残基(Asp32)上的羧基作为广义碱从水分子中抽取一个质子,随之产生的OH-亲核进攻肽键上的羰基碳,形成氧负离子。氧负离子再转而亲核进攻活性中心pKa低的Asp215残基上的羧基,从中夺取质子,于是pKa低的Asp残基充当广义酸,为氧负离子提供质子,形成四面体状中间物。
3. Asp32和Asp215相互之间进行酸碱反应,质子从Asp32传到Asp215。
4. Asp32和Asp215的酸碱催化导致四面体中间物的拆分,产物得以释放。最后Asp32和Asp215再次进行质子交换,从而使得它们各自回到催化前的状态。
属于金属蛋白酶的有:嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、羧肽酶A(carboxypeptidsase A,CPA)和B,这里以CPA为例简要说明它们的催化机理。
CPA 主要催化肽链C-端为芳香族氨基酸或侧链较大的脂肪族氨基酸残基的水解。它属于使用Zn2+进行催化的水解酶家族的一员,属于这一家族的水解酶还有血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme)、胶原酶(collagenase)和某些细胞外基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)。
图e10-1(1) 羧肽酶A疏水口袋与底物的结合以及作为广义碱催化的Glu270
CPA的特异性由其活性中心的形状和化学性质决定,多肽底物结合在疏水口袋之中。疏水口袋特别适合容纳C-端为芳香族或较大的脂肪酸氨基酸的侧链。参与对多肽底物C-端氨基酸残基选择的有Asn144、Arg145和Tyr248,它们与末端羧基以氢键结合[图e10-1(1)]。CPA的两个催化基团一个是Glu270,另一个Zn2+,它们直接参与水解反应。Glu270 作为一个广义碱,激活作为弱亲核进攻试剂的水分子,或者自己作为亲核基团直接进攻肽键上的羰基碳;Zn2+与CPA分子上的三个氨基酸残基——His69、His196和Glu72配位结合,如果没有底物,则还有一个水分子会与Zn2+配位结合,这个水分子很可能就是参与水解的。如果有底物,Zn2+就与底物C-端肽键上的羰基氧结合,产生临近和稳定效应。
关于两个催化基团催化的确切机制还有争议[图e10-1(2)],一种观点认为(机制A),Glu270直接作为亲核催化剂,进攻肽键的羰基碳,导致羧酸酐中间物的形成,而Zn2+是作为亲电催化剂将底物水分子“抓”到中间物旁边;另一种观点认为(机制B),Glu270和Zn2+分别作为广义碱和Lewis酸进行催化。
图e10-1(2) 羧肽酶A的两种催化机制
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