基因工程：第四章-酵母基因工程.ppt

甲醇酵母系统分泌表达载体 信号肽：PHO1 甲醇酵母系统分泌表达载体 信号肽：MF-? pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点 4）甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策 载体稳定性 基因剂量 整合位点 甲醇利用表型 mRNA 5’端 AT含量分泌信号 表达产物稳定性 ① 载体稳定性 采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚。 同拷贝数时，整合型比自主复制型表达水平高。 YRp型载体的稳定化： 选择-非选择培养交替数十代可得稳定的整合子，但费时、整合位点不确定。 ② 基因剂量 构建高拷贝整合型表达载体。 外源基因表达存在基因剂量效应。 筛选多拷贝整合子 载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。 体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子； 采用YRp型载体稳定化技术，获高拷贝整合子； ③ 整合位点 毕赤酵母中个别情况整合于His4位点的比AOX1位点的低。 外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均可高效表达； ④ 甲醇利用表型 在分泌表达情况下，甲醇利用慢型（Muts）更利于表达。 ⑤ mRNA 5’端 应尽量避免在UTR区出现AUG和次级结构。 mRNA 5’端非翻译区（UTR）的组成与长度应尽量与AOX1/MOX的一致； AOX1基因5’-UTR长114nt，富含A+U，其编码的乙醇氧化酶表达量极高。 ⑥ 基因序列的AT含量 AT含量越高，越容易出现类似于终止子的结构。 对A+T含量丰富的基因，最好重新设计序列，使其(A+T)含量在30-55％范围内。这种方法使人血清白蛋白(HAS)的表达量提高50倍。 ⑦ 分泌信号 可采用酿酒酵母来源的MF-?、PHO或SUC等的信号肽，或野生型信号肽，但要比较分析适用性。 分泌表达效率与所用信号肽密切相关； 采用蛋白酶缺陷宿主株： 如P.pastoris SMD1168。 ⑧ 表达产物稳定性 分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素。 降低培养基pH值： 蛋白酶在酸性条件下活性较低。 向培养基中添加蛋白胨或酪蛋白水解物： 竞争性抑制蛋白酶活性。 目前，20余种重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中成功表达，如：人血清白蛋白(HSA)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)等。 数种重组蛋白在多形汉逊酵母表达系统中成功表达，如HBsAg。 （六）利用重组酵母生产乙肝疫苗 乙肝病毒的结构与性质 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 由乙肝病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重传染病，每年约200万病人死亡，3亿人成为HBV携带者，其中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌。 利用酵母大规模生产乙肝疫苗为其应用提供了保证。 目前对HBV还没有一种有效的治疗药物，乙肝疫苗可有效预防病毒感染。 HBV的结构与性质 HBV是蛋白包裹型的双链DNA病毒，有感染力的病毒颗粒呈球面状，直径42nm，基因组3.2kb。 HBV的结构： 病毒颗粒主要结构蛋白是病毒表面抗原 (HBsAg)；颗粒内蛋白包括核心抗原(HBcAg)、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。 HBsAg：HBV包膜糖蛋白，包括小分子(S)、中分子(M)、大分子(L)表面抗原三种形式。? HBsAg编码基因： ATG ATG ATG TAA 108aa 55aa 226aa preS1 preS2 S S蛋白 226aa M蛋白 281aa L蛋白 399aa S蛋白可刺激机体产生中和抗体，是制备乙肝疫苗的主要成分。 S蛋白： 即小分子HBsAg，是构成HBV包膜的主要成分，大量存在于感染者血清中，是感染HBV的主要标志。 HBV在体外细胞培养基中不能繁殖，第一代乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取的。 质膜来源的疫苗有较高的免疫原性，但受原材料限制，难以产业化。 传统乙肝疫苗的制备： 产乙肝HBsAg的重组酿酒酵母 20世纪80年代始，选择酿酒酵母表达重组HBsAg。 将S抗原基因置于ADH1启动子下，获得有免疫活性的重组蛋白，以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平均直径22nm，结构和形态与慢性HBV携带者血清中的病毒颗粒相同。 以酿酒酵母生产的重组HBsAg颗