发光免疫分析技术原理和特点.ppt

发光免疫分析技术的 原理和特点  生物发光和化学发光 生物发光和化学发光作为两个古老而又年 轻的技术,近年来得到了很大的发展。尤 其在生物医学领域得到了广泛应用,已成 为现代生物技术的组成部分。发光免疫分 析技术及荧光素酶报告基因的应用已形成 业。近几年在某些关键技术如生物传 感器、基因序列分析、活体细胞ATP测定 等方面取得了突破,其应用的范围进一步 扩大,涵盖了生物医学的各个领域  生物发光 所谓的生物发光,就是生物体内发光蛋白通过 消耗能量物质而产生的发光现象。其特点为只 消耗能量物质,不消耗发光物质 萤火虫发光系统的量子效率,即产生光子数与 消耗能量物质(ATP)分子数之比接近百分 百,这是至今为止发光效率的最高纪录。因为 即使是目前最先进的节能灯,其发光效率仅为 20-30%左右 生物发光和化学发光均属于冷光范畴,即发光 不是由于发光体温度升高所至,发射波长也与 其温度无关  自从萤火虫发光系统被揭示以来 年的努力,目前发现存在发光现象 细菌、真菌、昆虫、蠕虫、水母、鸟乌贼、 鱼类、虾类等共有700多个种类,涉及17 个门,其中绝大多数生活在海洋、特别是 深海,有报道说在海平面数百米以下的大 部分物种多具有生物发光现象。这些发光 生物大部分为自身表达发光蛋白,而某些 鱼则利用共生菌发光。生物发光的波长几 乎涵盖了所有的可见光区域。  发光对于动物的主要意义包括求偶 进攻等。有人认为细菌发光可能也属 保护机制,目的在于消耗细胞内过多的氧化性物 质。近年来,发现许多种发光强度、波长和闪了 频率的变化尤其特定的含义,说明生物发光也许 是生物个体间相互交换信息的一种手段 近年来,随着越来越多的发光蛋白被提纯,其编 码基因序列被测定、表达。其发光底物被人工 成相关的基础研究和产品的商业化进程迅速,已 经发现的发光蛋白及其结构、活性部位、催化机 理已被人们所认识。  化学发光 化学发光是由于化学反应,通常是氧 电子能级处于激发态的物质,后 特耗光和:简兩量 致的发光 其 子效率相对较低。 化学发光按化学反应类型可分为酶促化学发光 和非酶促化学发光两类 其中酶促化学分光包括辣根氧化物酶系统、碱 性磷酸酶系统、黄嘌呤氧化酶系统 在碱性磷酸酶反应体系 金刚烷环氧 物苯磷酸酯及其衍生物可作为发光剂,又可 为氧化剂 通过自身内氧化,启动发光反 应而无需氧化剂 非酶促化学发光包括吖啶酯系统、草酸酯系  如果按发光持续时间分类,可分为闪龙秘 闪光型发光时间在数秒内,如吖啶酯系统 测方式一般采用原位进样和时间积分 在检测器部位加装进样器,并保证加入发光剂和 检测两个过程同步进行,同时以整个发光信号峰 的面积为发光强度 辉光型发光时间在数分钟至数十分钟以上,如辣 根过氧化物酶—鲁米诺系统、碱性磷酸酶- AMPPD系统、黄嘌呤氧化酶一鲁米诺系统等。 其信号检测无需原位进样,一般以速率法测量 即在发光信号相对稳定的区域任一点测量单位时 的发光强度  事实上,许多物质既是生物发光底物 化学发光底物,甚至是化学发光增 物发光和化学发光在分子和量子机理 多相 近年来在常见的化学发光底物特别是螺旋金刚烷 环氧化物苯磷酸酯类和吖啶酯类的发光机理 发现,大多数化学发光底物及 而且该结构的存在 乎对于生物发光底物也具有非常重要的 跻的基化学趸粦討電字婴辏爱髡=B提出了 基于上述理论,人类模拟自然界生物发光底物的 賽发光波长几覆盏了所有的可见死城,量子 淮花婴众敦來进:步鬲醫集物 生物发光是人  发光信号的检测 以往的光信号检测仪器大多采用光敏极管 光敏电池、电荷耦合器,或者以光电流放大方 式工作的常规光电倍增管作为检测器件。其原 理为:通过光电转换器件激昂光信号转换为电 压或电流信号,再加以放大。其主要特点为: 结构简单、性能稳定、但灵敏度低、线性范围 较窄 随着现代量子物理学的发展,以及人们对光的 微观特性认识的逐步深入,一种被称为单光子 计数器的新型高敏感度光电检测器在近期问世 其灵敏度及线性范围均大大超过其它常规技术  单光子计数器核心部件是一个光电倍 个超高度真空的玻璃容器,称为光阴 部还装有多个以特殊方式排列的电极,称为 极或加速极,其后部另有一个电极称为阳极,上 述各个电极之间均有直流高压 当光子打到光阴极时,由于光电效应,其表面可 以产生能量微弱的游离电子,称为光电子。该电 子由于直流高压的作用离开光阴极再次打到第 打拿极上,由于其获得了直流高压提供的能量, 因而在第一打拿级上又制造出了能量更大、能量 更多的电子,就这样经过多个打