【创意版】化学遗传学方法.ppt

二、正向化学遗传学 传统的正向遗传学(forward genetics)是从细胞特定的形态“表型”(phenotype)出发，最终达到分离相关基因或基因群的目的。 例如，科学家们通过对果蝇的卵进行放射处理来诱导随机性的基因突变，如果科学家们对果蝇的翅膀发育有兴趣，他们将从经过放射处理的卵所孵化的果蝇当中选择那些翅膀有缺陷的个体(如翅膀较小的个体)，并对果蝇的基因组进行扫描，找出发生变异的基因。一旦某个基因被确定并分离出来，将会开展一些能够表明这一基因对翅膀的正常发育有重要影响的试验。 0.0 * 正向遗传学方法 它的研究过程通常分三步来实现。首先，促使细胞和机体组织随机突变(比如通过x射线照射的方式)；然后，选择具有特定表型的细胞或机体来进行进一步研究；最后，确定引起特定突变的基因。 0.0 * 0.0 * 正向化学遗传学的目标是找到对生物活性小分子敏感的蛋白，其基本思路是：先用一系列的小分子来处理所要研究的细胞或有机体，然后鉴定出所需要的表型，最后找出生物活性小分子所作用的靶蛋白。 正向化学遗传学 0.0 * 正向化学遗传法自身具有较高的发现能力，因为它不需要预先知道太详细的生物机理，就可以找到能与小分子作用的包含在某一特定过程中的已知蛋白，还可以找到在该过程中未知的蛋白。 正向化学遗传学同时还提供了可以干扰靶蛋白的新的工具分子，它面临的挑战是能否找到高效准确地确定新表型的方法。 0.0 * 1，正向化学遗传学实例-myoseverin的发现 （1）2,6,9-三取代的嘌呤库的构建 碱基是核苷酸的基本结构单位之一，已有许多经结构修饰的碱基成为药物,并在抗菌及抗肿瘤中起着重要作用。 Chang和Schultz等人以几种细胞周期依赖性激酶（CDKs）和其天然的抑制剂Olimoucine为基础，选择嘌呤环作为多样性合成的骨架，将固载化的胺与2-氟-6-氯嘌呤反应得到与树脂相连的嘌呤，然后引入另外两个取代基。该方法能够在3个位置上引入不同的取代基，构成了2,6,9-三取代的嘌呤库。 0.0 * 0.0 * （2）高通量筛选 细胞周期的正常运行决定着细胞的增殖、分化和凋亡,受周期蛋白(cyclin)、周期蛋白依赖性激酶(cyclidepedent kinase, CDK)和周期蛋白依赖激酶抑制剂(CDK inhibitor, CKI)在多个层次上共同调节，2,6,9-三取代的嘌呤化合物可以作为周期蛋白依赖性激酶CDK1和CDK2抑制剂而用于抗肿瘤研究。 但是对于已经分化的神经原细胞和肌肉细胞来说，细胞很少再分裂增殖。因此, 细胞一旦受伤, 细胞生长受到阻碍, 恢复起来很难，因此，人们希望找到一种化合物来引起肌肉细胞分化, 达到再生目的。 0.0 * 骨骼肌细胞细胞分化的特点是一个单核成肌细胞融合成多核的肌管的过程，为了形成肌管，成肌细胞必须停止分裂。在这个过程中，细胞表达肌细胞专一性转录因子，如MyoD、Myf 5、 MEF2、肌浆蛋白以及细胞周期调节蛋白，如周期蛋白A（cyclin A）等。这些变化导致特征性标志物表达，如骨骼肌肌球蛋白重链(SMMHC)和乙酰胆碱受体。 在两栖动物的肢再生期间，多核的肌管解体成能够生长并裂变裂成单细胞的单核碎片，这就说明在某些脊椎动物肌肉可以通过肌管解体再生。为了探索在哺乳动物细胞这种肌肉再生的可能性，将2,6,9-三取代的嘌呤库用于体外筛选可以使分化的鼠肌细胞（C2C12）肌管裂变的小分子化合物。 0.0 * Rosania等人将几百个2,6,9-三取代嘌呤类化合物库加入到生长多天的肌细胞（C2C12）96孔培养板上,采用MTT方法和荧光标记进行细胞表型筛选，找到了一种能够诱导多核的肌管可逆地裂变成为单核碎片的化合物，命名为myoseverin。 0.0 * 从图 中可以看出在myoseverin处理之前, 细胞连接成一个整体（图C）, 但是在肌细胞培养液中加入20?mol/L Myoseverin处理24h后, 可以明显看到细胞相互分离（图D，而多核的肌管可逆地分裂成为单核碎片（图B）。 如将化合物除去，将细胞转移至新鲜的培养介质中后，肌管分裂促进了DNA合成和细胞增殖。转录过程和生物化学实验表明单独的myoseverin并不能逆转生物化学分化过程。 Myoseverin还可影响一些生长因子、免疫调节因子的表达。事实上, myoseverin被注入组织后, 一部分肌细胞就可期望再度生长并增殖, 因而产生新的肌肉组织。 0.0 * （3）检查化合物相连的目标蛋白质 肌细胞的表型筛选表明了myoseverin可以使肌管裂变，但是myoseverin是与哪种细胞生物活动过程中的目标蛋白质发生作用呢？根据肌管的细胞结构，预计肌管的裂变过程与细胞结构的骨架蛋白质有关, 所以使用带有荧光标记的抗微管抗