12蛋白质结构测定和分析.ppt

X-ray 360 °衍 射图： …… 各种方法获得初始相角 并改善其品质 电子密度计算 Tracing 相角问题求解 晶 体 衍 射 数 据 修正 ? ( xyz ) |F( hkl )| 最终模型 初始模型 关键问题：相位解决 蛋白质分子结构，即根据蛋白质 电子密度 构建的分子模型。 )] hkl ( ) lz ky hx ( 2 cos[ | ) hkl ( F | V 1 ) x yz ( hk l ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ?? ? 参考 f(x) = A cos(2 ? x – ? ) )] hkl ( i ) lz ky hx i( 2 ex p[ | ) hkl ( F | V 1 ) x yz ( h k l ??? ? ? ? ? ? ? ? ? 上式也可表示为： ? ? 为电子密度， xyz 为实空间坐标 ? V 为晶胞体积 ? |F(hkl)| 2 = I(hkl) ， I 代表衍射点的强 度， hkl 为衍射点坐标 ? ? 代表初始相角 h k f(x) = A cos(2 ? x – ? ) ? = 0 x 1 2 3 4 0 ? = ? /2 x 1 2 3 4 0 ? = - ? x 1 2 3 4 0 0 0 对于一束 X- 射线 f(x) = A cos(2 ? x – ? ) 来说，无论它的初始相角是多少，它在接收 屏上所形成的曝光点都是相同的。反之，我们只根据接收屏上的曝光点也是无法得 知造成该曝光点的 X- 射线的初始相角信息的。 初始相角无法直接测量得到，但它又是求解电子密度时所必需的信息。这就是 X- 射 线晶体衍射法解析物质结构时所需要解决的核心问题 —— 相位（相角）问题 。 解决相位问题的方法： ? 同晶置换法 最原始的方法，包括多对同晶置换法和单对同晶置换法。需 要在蛋白质晶体中引入重原子，并且要求引入了重原子的晶体与 未引入重原子的晶体的晶型基本相同。解析过程需要未引入重原 子、引入了重原子，甚至引入了不同重原子的多颗晶体的多套衍 射数据。 ? 反常散射法 包括多波长反常散射法和单波长反常散射法。通常需要引入 具有较强反常散射能力的原子，如硒原子。不需要多颗晶体但往 往需要同一颗晶体在不同波长 X- 射线照射下的多套衍射数据。随 着技术的进步，目前蛋白质自身的硫原子也开始被用来作为反常 散射源。 ? 分子置换法 需要同源性较高的蛋白质分子结构模型，不需要多颗晶体， 不需要多套衍射数据，方便快捷，但不能用来解析全新的结构。 透射电子显微镜技术 透射电子显微镜技术是以电子束为光源的显微成像技术， 其成像原理与普通光学显微镜基本一样，但电子束的波长比可 见或紫外光要短得多，因此其分辨率得到很大的提高，目前 TEM 的分辨力可达 0.2nm 。 透射电子显微镜技术 阀门 显示屏 电子枪 聚光镜系统 样品杆 c) 阀门 样品杆 显示屏 仪器示意图 透射电子显微镜技术 优点 ? 对比度好 ? 信噪比高 ? 操作简便 ? 耐电子辐射 不足 ? 由于脱水作用而变形失真 ? 由于染色剂的 pH 和离子强度而变形失真 ? 仅显示外围轮廓 ? 成像依赖染色的质量 ? 周围背景过高 ? 分辨率有限 Curr Protoc Protein Sci. 2005 Dec;Chapter 17:Unit 17.2 负染技术 低温透射电子显微镜技术 Curr Protoc Protein Sci. 2005 Dec;Chapter 17:Unit 17.2 Physiology 21: 13-18, 2006 速冻技术 优点 ? 将样品保留在液相中 ? 维持了天然结构 ? 高分辨率 ? 揭示内部结构 不足 ? 设备及操作要求较高 ? 信噪比低 生物样品为什么需要低温： 脂质体负染图 脂质体冷冻电镜图 为什么需要低温：冷冻超薄切片举例 为什么需要低温：冷冻负染举例 低温样品制备 VITROBOT - VITRIFICATION ROBOT ? Incubation of suspension on grid (holey carbon or Quantifoils) at constant temperature and humidity ? Automated blotting ? Plunge freezing in liquid cryogen (ethane, propane) ? Investigation in amorphous ice C-film Suspension with macromolecules Cryo-holder workstation 低温样品转 移 过程 ， 低于 -170 ° C Cryo-holder worksta