生化分离与纯化技术 细胞破碎常见技术 细胞破碎.ppt

将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。 反复冻融法 缺点：适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。 （6）干燥法 气流干燥 真空干燥 喷雾干燥 冷冻干燥 酶溶法 化学试剂破碎法 外加酶法 自溶法 表面活性物质 EDTA螯合剂 有机溶剂 变性剂 2.化学破碎（Chemical permeation） （1）酶溶法（Enzymatic Lysis） ①外加酶法 常用的溶酶 G+ 溶菌酶、适量抑制剂 G- 溶菌酶、EDTA 放线菌 溶菌酶 酵母菌 β-葡聚糖酶 霉菌 几丁质酶、 植物 纤维素酶、半纤维素酶 细胞壁溶解酶是几种酶的复合物 某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。 （2）化学试剂破碎法（Chemical permeation） 该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。 用碱处理细胞，可以溶解除去细胞壁以外的大部分组分。酸处理可以使蛋白质水解成游离的氨基酸。 能溶解细胞壁中的磷脂层，使细胞破坏。 有机溶剂 变性剂 盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲（Urea）是常用的变性剂。 常用的有机溶剂：丁酯、丁醇、甲苯、二甲苯、氯仿及高级醇等。 变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。 通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50% 有些化学试剂有毒 。 化学法的优点： 缺点： 对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。 * * LOGO LOGO 细胞破碎1 细胞破碎就是采用物理、化学、酶或机械的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中。 概念 细胞破碎机理图 微生物 革兰氏阳性细菌 革兰氏阴性细菌 酵母菌 霉菌 壁厚/nm 20-80 10-13 100-300 100-250 层次 单层 多层 多层 多层 主要组成 肽聚糖 (40-90%) 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1-4%) 肽聚糖 (5-10%) 脂蛋白 脂多糖 (11-22%) 磷脂 蛋白质 葡聚糖 （30-40%） 甘露聚糖 （30%） 蛋白质 (6-8%） 脂类 (8.5-13.5%) 多聚糖 （80-90%） 脂类 蛋白质 细胞壁的结构和特点 细胞破碎的阻力 细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大 酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度 霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构 成熟的植物细胞壁分为初生壁和次生壁 细胞的破影响因素 物理破碎时影响因素： 细胞的大小 形状 细胞壁的厚度 聚合物的交联程度 酶法和化学法溶解细胞影响因素： 组成 结构 细胞破碎方法（按是否使用外加作用力） 分 类 作 用 机 理 适 应 性 机 械 法 珠磨法 固体剪切作用 可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难 高压匀浆法 液体剪切作用 可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌 超声破碎法 液体剪切作用 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作 X-press法 固体剪切作用 破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合 非 机 械 法 酶溶法 酶分解作用 具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差 化学渗透法 改变细胞膜的渗透性 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差 渗透压法 渗透压剧烈改变 破碎率较低，常与其他方法结合使用 冻结融化法 反复冻结-融化 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物 干燥法 改变细胞膜渗透性 条件变化剧烈，易引起大分子物质失活 分 类 作用机理 适应性 物理破碎 高压匀浆法 液体剪切作用 可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌 珠磨法 固体剪切作用 可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难 超声破碎法 液体剪切作用 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作 渗透压法 渗透压剧烈改变 破碎率较低，常与其他方