第五节 生物大分子相互作用研究技术-PPT.pdf

第二十章 常用分子生物学技术 第一节 核酸分子杂交 第二节 聚合 酶链反应 第三节 基 因文库 第四节 生物芯片技术 第五节 生物大分子相互作用研 究技术 1 一、蛋白质相互作用研究技术 n常用蛋白质相互作用的研究技术 • 酵母双杂交 • 各种 亲和分析 （标签蛋 白沉淀、免疫共沉淀等） • 荧光共振能量转换效应分析 • 噬 菌体显示 系统筛选 2 （一）标签蛋白沉淀 标签融合蛋 白结合实验是一个基于亲和 色谱 原理的、分析蛋 白质体外直接相互作 用的方法。 标签融合蛋 白结合实验主要用于证 明两种蛋 白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结 合的具体结构部位及筛选细胞 内与融合蛋 白相结 合的未知分子。 3 标签融合 蛋白沉淀 实验流程 示意图 GST-tag:谷 胱甘肽S-转移 酶标签 4 （二）酵母双杂交技术的基本原理和用途 DNA结合功能 域 （DNA binding domain,DNA -BD） 转录激活结构 域 （activation domain， DNA-AD） 5 n酵母双杂交系统的应用 • 证 明两种 已知基 因序列的蛋 白质可以相互作 用 的生物信 息学推测。 • 分析 已知存在相互作 用的两种蛋 白质分子的的 相互作 用功能结构域或关键 的氨基酸残基。 • 将拟研 究的蛋 白质 的编码基 因与BD基 因融合成 为 “诱饵”表达质粒 ，可以筛选AD基 因融合的 “猎物”基 因表达文库 ，筛选未知 的相互作 用 蛋 白质 。 6 二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术 （一）电泳迁移率变动测定 电泳迁移 率变动测定(electrophoretic mobility shift assay ，EMSA) 或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay) 最初 用于研 究DNA 结合蛋 白与相应DNA序列 间的相 互作 用 ，可用于定性和 定量分析 ，已经成 为转 录因子研 究的经典 方法。 目前这一技术也被 用于研 究RNA 结合蛋 白和特定RNA 序 列 间的相 互 作 用。 7 n凝胶迁移实验结果示意图 未标记探针 10X 核蛋白提取物 1X 10X 10X 标记探针 1X 1X 1X 1X 结合有蛋白的探针 放 射