Bio-Rad QX200微滴式数字PCR 实验操作指南.doc

V1.0 PAGE1 / NUMPAGES19 Bio-Rad QX200微滴式数字PCR 实验操作指南 地区：中国版本：1.0 QX200实验流程简介 样本核酸提取数据分析 样本核酸提取 数据分析 制备微滴 制备微滴 PCR扩增 PCR扩增 检测微滴 检测微滴  目 录 TOC \o 1-3 \h \z \u 流程简介 2 第一章 实验耗材清单 4 第二章 QX200实验流程 5 第三章 QX200软件操作 10 第一章 实验耗材信息 耗材列表： DG8 Catridges（货号：1864008） DG8 Gaskets（货号：1863009） Droplet Generator oil for probes （货号：1863005） ddPCR Droplet Reader oil（货号：1863004） ddPCR Supermix for probes （货号：1863026） Pierceable Foil Heat Seal（货号：1814040） PCR Plate 96,semi-skirted（货号 8连管 1.5ml Tubes 96-well plate holder Eppendorf tube rack Rainning multiple-channel Pipettestips (50ul,100ul) pipettor and tips - 10ul pipettor and tips - 100ul pipettor and tips - 200ul Generator oil 储液槽 无酶水 设备列表： Droplet generator （货号：1864002） Dropler reader（货号：1864003） PX1 PCR plate sealer（货号：1814000） Thermal cycler(T100 货号：1861096 OR C1000 Touch 货号：1851196) 小型离心机(1.5ml tube and 8连管适配器) 漩涡震荡仪 第二章 QX200实验流程 一、标本的提取 组织样本DNA的提取 组织样本DNA的提取使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit，详细方法参照试剂盒说明书 血浆样本的ctDNA提取 cfDNA的提取使用 QIAamp DNA blood mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)，采用Spin Procedure方案。详细方法参照试剂盒说明书 二、QX200实验 Bio-Rad QX200? Droplet? Digital PCR系统工作流程如下图，包括ddPCR反应液配制、微滴制备、PCR扩增、微滴读取、数据分析，显示结果6个步骤 先打开QX200 Droplet Reader后面电源，预热至少30分钟后打开电脑和QuantaSoft软件； 配制ddPCR 反应液 A. 配制20ul探针法定量反应体系，选用适宜的探针法预混液（注：RNA作为模板时选择One-Step RT-ddPCR Kit for Probes），推荐终浓度900nM Primer+250nM Probe，振荡混匀，离心除气泡，注意20ul体系中所加样本核酸含量不要超过规定检测范围(1~100000拷贝片段化核酸或者1~20000拷贝完整基因组DNA)，如完整的人类基因组DNA不要超过66ng/20ul，可提前用限制性内切酶处理样本可提高检测浓度。另外，用质粒作为模板时建议酶切以消除复杂结构，做CNV实验时必须对DNA模板进行高频酶切； B. 配制20ul染料法定量反应体系，选用QX200 ddPCR EvaGreen Supermix，推荐终浓度100nM Primer，单孔模板检测范围为1~30000拷贝片段化核酸或者1~20000拷贝完整基因组DNA，其他同上。 Reaction Components Component Volume Per Reaction (μl) 2 × ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)/ QX200 ddPCR EvaGreen Supermix 10 primers/probe variable(探针法推荐引物终浓度900nM，探针终浓度250nM；染料法推荐引物终浓度100nM) H2O variable DNA Sample variable Final Volume 20 μl 将一个新的DG8 cartridge放入holder中，注意缺口