实验三-植物组织RNA的提取与分析.ppt

* 实验三 植物组织RNA的提取与鉴定 * （1）通过本实验，了解RNA的结构和特点。 （2）学会使用Trizol法提取植物总RNA。 （3）学习和掌握总RNA的检测实验技术和实验原理。 一、实验目的 二、实验原理 RNA的提取是进行分子克隆和基因表达分析等研究的基础。但RNA很容易被内源及外源的RNase降解，所以要得到未被降解的、不含DNA与其它杂质的RNA是进行分子生物学研究的前提。 目前较为成熟的分离RNA的方法有许多，用于植物细胞总RNA的提取主要有苯酚法、异硫氰酸胍法、氯化锂沉淀法、SDS/酚抽提法，或应用商品化的Trizol试剂和Qiagen等各类试剂盒进行提取。但由于植物细胞具有坚硬的细胞壁，内含较多的多糖、脂质、多酚等次生代谢物，同种植物的不同组织和不同植物的同种组织材料，其RNA的提取方法也会有很大差异。适宜的RNA提取材料处理方法也不尽相同。 二、实验原理 Trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。 用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少，可以用来做Northern，RT-PCR，分离mRNA，体外翻译和分子克隆等。 * 三、仪器和试剂 1、仪器： 高速冷冻离心机、微波炉、稳压电源、水平电泳槽、凝胶成像系统。 2、材料与试剂： 液氮、Trizol、氯仿、异丙醇、70%乙醇、DEPC处理的蒸馏水、琼脂糖、1×TAE、上样缓冲液。 * 四、实验步骤 1、RNA的提取 （1）称取0.1g新鲜植物叶片（小麦、烟草、吊兰等均可）置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末，快速将全部粉末转入1.5mL的无RNA酶的离心管中。 （2）向离心管中快速加入1mLTrizol，充分混匀后室温下放置5min。 （3）4℃，12000r/min离心10min。 （4）吸取上清液置于一个新的1.5mL的无RNA酶的离心管中，加入200uL氯仿，剧烈震荡1min，室温放置3min。 * 四、实验步骤 1、RNA的提取 （5）4℃，12000r/min离心10min。 （6）吸取上清液置于一个新的1.5mL的无RNA酶的离心管中，加入600uL异丙醇，-20℃放置30min。 （7）4℃，12000r/min离心10min。弃去上清液。 （8）向离心管中加入1mL70%乙醇，漂洗沉淀物。4℃，5000r/min离心3min。弃去上清液。（此步可省略） （9）待沉淀物自然干燥后，加入20uLDEPC处理的蒸馏水，充分溶解后，即为RNA溶液。 * 四、实验步骤 2、RNA电泳检测 （1）1%琼脂糖凝胶：称取0.2g琼脂糖，加入20mL 1×TAE缓冲液，加入20uL甲醛溶液（可省略），在微波炉中加热，反复加热、振荡2-3次，使琼脂糖充分融化。待凝胶冷却至60℃左右，倒入插入梳子的凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。 （2）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右摇晃，以免破坏胶面及加样孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中，加样孔靠近阴极的一端。 * 四、实验步骤 2、RNA电泳检测 （3）上样电泳：将5μLRNA样品溶液和5μL上样缓冲液混匀后，上样，100V稳压电泳检查，根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。 （4）照胶、拍照：将凝胶泡在EB溶液（注意：EB溶液为剧毒物，需带上一次性手套拿取凝胶）中5min左右，进入暗室，使用凝胶成像系统照胶并拍照。