crisprcas9基因敲除载体构建试剂盒使用说明书v11.doc

CRISPR Cas9 基因敲除试剂盒 产品说明书 本说明书适用于以下产品： 货号 货号 CRISPR/Cas9 试剂盒 CR0001 CRISPR/Cas9Nick 试剂盒 CR0002 pCas9/gRNA1 载体 CR1001 pCas9/gRNA3 载体 CR1004 pTYNE 验证载体 CR1011 V2.0 北京英茂盛业生物科技有限公司 北京市昌平区沙河镇青年创业大厦 B‐916 Tel：010Emai：order@ Web site： 产品说明书 产品内容 Cas9 基因敲除试剂盒 货号 CR0001 内容 包装 pCas9/gRNA1 载体 3ug in TE Buffer pTYNE 验证载体 3ug in TE Buffer pCas9‐P 阳性对照载体 3ug in TE Buffer pCas9‐N 阴性对照载体 3ug in TE Buffer Cas9Nicknase 基因敲除试剂盒 货号 CR0002 内容 包装 pCas9/gRNA3 载体 3ug in TE Buffer pTYNE 验证载体 3ug in TE Buffer pCas9‐Pf 阳性对照载体 3ug in TE Buffer pCas9‐Pr 阳性对照载体 3ug in TE Buffer pCas9/gRNA1 载体 货号 CR1001 内容 包装 pCas9/gRNA1 载体 3ug in TE Buffer pCas9/gRNA3 载体 货号 CR1004 内容 包装 pCas9/gRNA3 载体 3ug in TE Buffer pTYNE 验证载体 货号 CR1011 内容 包装 pTYNE 验证载体 3ug in TE Buffer 保存条件： ‐20℃冻存 所需其他材料 ? EcoRV 限制性内切酶。T4 DNA ligase。 ? dH5a、Top10 或其他常用感受态细胞。 ? 细胞培养基及其他细胞培养相关试剂。 ? HEK293T 细胞或 293V 细胞（货号 C1201）。 ? 转染试剂（Polyfect‐V 货号 P2010‐1）。 1 北京英茂盛业生物科技有限公司 Tel: 010Email: order@ 产品说明书 CRISPR Cas9 基因敲除原理 CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNA 或其 他外源 DNA 的免疫机制。在该机制中，Cas 蛋白（CRISP‐associated protein）含有两个核酸酶结构域，可以 分别切割两条 DNA 链。一旦与 crRNA（CRISPR RNA）和 tracrRNA 结合形成复合物，Cas 蛋白中的核酸酶即 可对与复合物结合的 DNA 进行切割。切割后 DNA 双链断裂从而使入侵的外源 DNA 降解。 1、Cas9 蛋白 来自 Streptococcus pyogenes 的 Cas9 由于 PAM 识别序列仅为 2 个碱基（GG），几乎可以在所有的基因中找 到大量靶点，因此得到广泛的应用。Cas9 蛋白在目前测试过的几乎所有生物和细胞中均有活性，包括细菌、 酵母、植物、鱼、以及哺乳动物细胞。识别 RNA（gRNA）可以通过载体表达或者化学合成后与 Cas9 蛋白 共同进入细胞，对特异 DNA 序列剪切，从而促使 DNA 发生 NHEJ ( nonhomologous end‐joining)导致的基因 缺失或同源重组，实现基因敲除。 Cas9 对 DNA 切割示意图： 2、Cas9Nicknase 蛋白 Cas9Nicknase 是 Cas9 蛋白的 D10A 突变体，切割 DNA 单链。由于 DNA 上的 Nick 缺口会很快被细胞修复， 一般不会造成基因突变。Cas9Nicknase 需要成对的 gRNA 辅助才能实现 DNA 双链断裂。 采用 Nicknase 蛋白可以提高基因敲除的特异性，但是对 gRNA 的设计要求较高。敲除效率也比 Cas9 蛋白 低一些。 简单地说，Cas9 基因敲除效率更高，操作更容易；Cas9Nicknase 特异性更高。您可以根据实验设计需要进 行选择。 Cas9Nicknase 对 DNA 切割示意图： 2 北京英茂盛业生物科技有限公司 Tel: 010Email: order@ 产品说明书 用pCas9/gRNA1 或pCas9/gRNA3 载体进 行基因敲除流程 设计基因敲除靶点 本 构建pCas9/gRNA载体 试 剂 盒 中 包 含 构建pTYNE验证载体 内 容 在pTYNE载体上进行靶点验证